蘋果HYL1基因在干旱中的表達與功能分析

王麗平，姜麗娟，馬鋒旺，管清美

(1 西北農林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌712100；2旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

蘋果(Malusdomestica)是我國溫帶地區(qū)最主要的栽培果樹之一，其優(yōu)勢產區(qū)多分布于干旱半干旱的溫帶地區(qū)。因此，干旱成為制約蘋果生產的主要因素。隨著分子生物學、組織培養(yǎng)和轉基因等生物技術的成熟與迅速發(fā)展，研究者克隆了大量的蘋果抗旱相關基因，并對其進行了模式植物擬南芥、煙草等的異位表達及對蘋果自身的遺傳轉化研究。

目前，通過基因工程和轉基因等生物技術手段已經獲得了一些抗旱性增強的轉基因植株。如蘋果CBL互作蛋白激酶MdCIPK6L基因，在轉基因擬南芥中能夠響應包括干旱在內的多種非生物逆境脅迫[1]；蘋果珠眉海棠MzASMT1基因轉入擬南芥后，在干旱處理下表達量顯著上調，其過量表達使擬南芥中褪黑素含量上調2～4倍，過表達擬南芥中內源活性氧(ROS)含量則顯著減少，從而使其具有更強的耐旱性[2]；同樣，將蘋果抗旱基因在煙草中異位表達也可以提高轉基因煙草的抗旱性[3-4]。近年來，也獲得了一些蘋果抗旱轉基因植株，如將蘋果MYB轉錄因子基因MdSIMYB1轉化蘋果后，過量表達的轉基因蘋果株系在各種非生物逆境條件下的抗性均出現顯著增強[3]；從新疆野蘋果中分離出DREBs轉錄家族中的一個基因MsDREB6.2，發(fā)現該基因在蘋果中過量表達可影響氣孔的開張密度和根系生長，從而能夠增強蘋果的耐旱性[5]。

HYL1(HYPONASTIC LEAVES 1)基因自首次被發(fā)現以來[6]，對其功能研究就主要集中在miRNA的合成方面，對其在抗逆尤其是抗旱機制中的功能研究尚未見報道。目前，HYL1的相關研究主要集中在模式植物擬南芥中且已經非常成熟，但在蘋果中的研究則剛起步，現有研究發(fā)現其在蘋果中主要參與了miRNA的合成、蘋果樹形結構的形成[7]、對IAA表達的響應[8]及非生物逆境脅迫[9]等過程。本研究通過克隆MdHYL1基因并將其轉化入蘋果，分析MdHYL1在蘋果抗旱過程中的功能，并通過轉基因手段獲得抗旱蘋果種質，以期為HYL1基因在抗逆分子機制中的研究及為蘋果抗旱遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 用于基因克隆和表達分析的試驗材料為金冠(M.domestica)和楸子(M.prunifolia)，用于轉基因的蘋果來自沈陽農業(yè)大學張志宏教授實驗室的無性系GL-3[10]。

1.1.2 菌株、質粒與試劑 大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)TOP10、pGWB414過表達載體、pDONR 222載體和用于遺傳轉化的農桿菌EHA105菌株等，均保存于西北農林科技大學園藝學院果樹逆境生物學團隊實驗室；用于構建Gateway載體的BP酶和LR酶，購于上海Invitrogen公司；DNA聚合酶購于北京全式金生物技術有限公司；反轉錄試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司，質粒小提試劑盒和DNA純化回收試劑盒購于天根生化科技有限公司；Premix RTaq、DNA Marker等購于大連寶生物工程有限公司；IAA、6-BA、IBA等植物激素購于Sigma-AIdrich中國公司；引物合成和測序由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2 蘋果MdHYL1基因的克隆

從擬南芥信息資源網站(Tair，http://www.arabidopsis.org/)中查找并下載AtHYL1蛋白的氨基酸序列，登錄號為AT1G09700。將這條序列放到美國國立生物技術信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中與蘋果基因組進行blastp搜索，篩選出一致性最高的蘋果基因序列，并據此設計MdHYL1基因克隆的特異引物(F：5′-ATGTCCA-CAAACGAAGGCTTTC-3′；R：5′-TTAGCACAT-ATGTTGCACCTGC-3′)。采用改良CTAB法提取金冠葉片總RNA[11]，將反轉錄得到的cDNA用作克隆MdHYL1的模板。PCR擴增體系如下：cDNA 0.2 μL，正向和反向引物各1 μL，dNTP 2.5 μL，TRANS 10×Pfu Buffer with MgSO45 μL，TRANS Pfu DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O補至25 μL。反應程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用回收試劑盒回收純化后連接到入門載體pDONR222上，再轉化至大腸桿菌感受態(tài)TOP10中，挑取陽性克隆，PCR檢測后測序。

1.3 蘋果MdHYL1基因的蛋白序列分析

運用NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的blastp功能，對已鑒定出的MdHYL1基因的蛋白序列進行比對，參數均為默認參數。將用于進化分析的物種蛋白序列下載下來，用DNAMAN軟件進行比對，輸出比對結果。然后使用MEGA 5.05，對蘋果(Malusdomestica)、桃(Prunuspersica)、梅(Prunusmume)、水稻(Oryzasativa)、黃瓜(Cucumissativus)、棗(Ziziphusjujube)、大豆(Glycinemax)、油菜(Brassicanapus)和模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)等9個物種的HYL1蛋白進行進化分析。以鄰近法(Neighbor-joining,NJ)構建進化樹，參數設置為：校驗參數Bootstrap method=500，其余參數為默認參數。

1.4 蘋果MdHYL1基因的表達分析

用于干旱脅迫下MdHYL1基因表達分析試驗的材料為3個月大嫁接于平邑甜茶上的金冠蘋果苗，生長條件為25 ℃，光照時間10 h/d。當土壤相對含水量為土壤最大含水量的85%時開始進行短期干旱處理，處理0，2，4，6，8 d后復水，在各時間點分別采樣，每7株1個重復，每個處理3個生物學重復。組織特異性表達試驗使用楸子蘋果苗，葉片RNA用改良CTAB法提取[11]，根、莖、花和果實RNA用天根生化科技有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取。

RNA完整性采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用RNA反轉錄試劑盒進行反轉錄。RT-qPCR使用美國Bio-Rad公司的CFX96TM熒光定量PCR儀進行，以MdMDH為內參基因(引物序列為：F.5′-CGTGATTGGGTACTTGGAAC-3′；R.5′-TGGCAAGTGACTGGGAATGA-3′)。

1.5 蘋果MdHYL1基因植物表達載體的構建

本試驗選用pGWB414載體作為MdHYL1過量表達載體。將去掉終止密碼子的MdHYL1全長序列轉化到中間載體pDonor222上，通過Gateway重組技術(Invitrogen)將該序列構建到帶有HA標簽和選擇標記基因NptⅡ的pGWB414載體上(結構如圖1所示)，然后將重組質粒用電擊法轉化農桿菌EHA105。

圖1 MdHYL1基因植物表達載體MdHYL1-pGWB414的結構Fig.1 Structure of MdHYL1 plant expression vector MdHYL1-pGWB414

1.6 蘋果MdHYL1基因的轉化與轉基因株系的鑒定

采用農桿菌介導的遺傳轉化方法[12],對蘋果無性系GL-3進行MdHYL1基因的轉化。將轉基因蘋果苗置于組培間，生長條件為溫度25 ℃，光照時間10 h/d，光照強度3 000～5 000 lx。

轉基因株系的鑒定采用PCR和RT-qPCR 2種方法。從采用卡那霉素篩選的抗性植株葉片中分別提取DNA和RNA，以提取的DNA為模板，使用特異性檢測引物(F：5′-CAAGTGGATTGATGT-GATATCTCCACTACG-3′；R：5′-AGAAGGCGC-ATGGGAAGG-3′)進行電泳檢測，以未處理的GL-3植株DNA為陰性對照。以轉基因株系RNA反轉錄的cDNA為模板，進行RT-qPCR檢測，定量引物為:F.5′-AGAAACCCACAGGAGACAAGGC-3′；R.5′-CATCATTATCGCAGGGAATCAAA-3′。內參基因使用MdHYL1表達分析所用的MdMDH基因。RT-qPCR反應體系為：GoTaq 10 μL，正向和反向引物各1 μL，cDNA 5 μL，ddH2O補至20 μL。RT-qPCR程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，45個循環(huán)；60～95 ℃，30 s，37個循環(huán)，即從第2個循環(huán)開始由60 ℃每次升高0.5 ℃,并在該溫度下保持30 s，37個循環(huán)后達到95 ℃。每個株系均包含3個生物學重復，RT-qPCR加樣時使用3個技術重復。用2-ΔΔCt法[13]計算MdHYL1基因在不同株系中的相對表達量。

1.7 MdHYL1過量表達轉基因蘋果根系的生長觀測

將MdHYL1過量表達轉基因蘋果株系和未轉基因對照同時進行擴繁生根，生根45 d后觀察轉基因株系與未轉基因株系(對照)的根系生長情況。同時，對根系數目進行統計，以6株為1個重復計算根系數目的平均值，每組3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 蘋果MdHYL1基因的克隆與序列分析

2.1.1 蘋果MdHYL1基因的克隆 將擬南芥HYL1蛋白序列與美國國立生物技術信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的蘋果基因組序列進行blastp比對，篩選出一致性最高的蘋果基因序列，登錄號為XP_008338962，根據其設計基因克隆的特異引物。以金冠蘋果葉片cDNA為模板，通過RT-PCR擴增出一段1 479 bp的序列(圖2)，全長開放閱讀框為1 479 bp，編碼492個氨基酸，位于chr15染色體上，將其命名為MdHYL1，與登錄號為XP_008338962的基因序列完全一致。

2.1.2 蘋果與其他物種HYL1蛋白序列的比對 將蘋果與桃、梅、水稻、黃瓜、棗、大豆、油菜、擬南芥等共9個物種的HYL1基因的蛋白序列進行比對，結果(圖3)顯示，9個物種的HYL1基因蛋白序列的N端較保守，均含有2個非常保守的雙鏈RNA結合結構域DSRM。

2.1.3 蘋果MdHYL1蛋白的系統進化分析 為了研究蘋果HYL1蛋白的系統進化過程，對蘋果、桃、梅等9個物種的HYL1蛋白進行了系統進化分析，用于構建進化樹的HYL1蛋白如表1所示。

表1 用于構建進化樹的其他8個物種的HYL1-like蛋白Table 1 HYL1-like proteins used to construct phylogenetic tree from other eight species

由構建的進化樹(圖4)發(fā)現，MdHYL1蛋白在進化上與薔薇科的梅和桃親緣關系最近，與擬南芥、水稻、歐洲油菜親緣關系較遠。

圖4 蘋果和其他物種HYL1蛋白的系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of HYL1 homologous proteins from apple and other species

2.2 蘋果MdHYL1基因的表達分析

2.2.1 蘋果MdHYL1基因的組織特異性表達 為了研究MdHYL1基因在蘋果不同組織和器官中的表達情況，分別提取了楸子根、莖、葉、花和果實的RNA，利用RT-qPCR的方法分析了MdHYL1基因在各器官組織中的表達。如圖5所示，MdHYL1在楸子各器官和組織中均有表達，其中在莖、葉和花中表達量較高。與根中表達量相比，MdHYL1在葉片中的表達量最高(3.85倍)，其次是莖(3.49倍)和花(3.30倍)，在果實中的表達量最少(0.10倍)。

2.2.2 蘋果MdHYL1基因在干旱脅迫下的表達 對金冠蘋果苗進行短期干旱處理，并利用RT-qPCR方法研究MdHYL1基因在干旱脅迫下葉片中的表達情況。如圖6所示，干旱處理不同時間MdHYL1基因表達量均上調，且隨著干旱處理時間的延長，MdHYL1基因的表達量出現先升后降的趨勢，在干旱處理6 d時表達量達到峰值，為處理0 d時的8.82倍；而在處理8 d后，MdHYL1基因表達量則稍微下降，但較未進行干旱處理的金冠蘋果仍呈現上調表達，達到4.17倍；復水后，MdHYL1基因的表達量則又重新恢復。上述結果表明，MdHYL1基因可以響應干旱脅迫。

圖5 MdHYL1在楸子中的組織特異性表達Fig.5 Tissue specific expression of MdHYL1 in Malus prunifolia

2.3 MdHYL1過量表達轉基因蘋果株系的鑒定

2.3.1 轉基因株系的PCR檢測 使用蘋果無性系GL-3為材料，通過農桿菌介導法對蘋果MdHYL1過量表達載體進行轉基因，共獲得3個對50 mg/L卡那霉素具有抗性的陽性株系，分別為OE#5、OE#10和OE#13。以這3個陽性株系的DNA為模板進行PCR檢測，由于35S引物結合不特異，選取了pGWB414載體上35S上游的一段序列為正向引物，以MdHYL1全長開放閱讀框上的一段序列作為反向引物進行PCR擴增。結果顯示，3個陽性株系中均克隆出含有該片段的條帶，而未進行轉基因的GL-3株系則沒有出現該條帶(圖7)，表明這3個轉基因株系中存在MdHYL1基因的插入，從DNA水平上可初步確認為轉基因株系。

圖7 MdHYL1過表達蘋果株系的PCR檢測Fig.7 PCR identification of MdHYL1 overexpression transgenic apple lines

2.3.2 轉基因株系的RT-qPCR檢測 從3個轉基因陽性蘋果株系的葉片中提取RNA，并進行了RT-qPCR檢測分析，結果見圖8。

圖8 MdHYL1在過表達轉基因蘋果株系中的mRNA相對表達量Fig.8 Relative mRNA expression of MdHYL1 in overexpression transgenic apple lines

圖8表明，與陰性對照GL-3相比，3個轉基因陽性株系中MdHYL1的表達量均出現上調，OE#5、OE#10和OE#13的相對表達量分別為GL-3的2.03倍、2.02倍和3.61倍，表明3個株系從轉錄水平上也可確定為MdHYL1過量表達株系。

2.4 MdHYL1過量表達轉基因蘋果株系根系的生長情況

將鑒定出來的3個MdHYL1過量表達轉基因株系進行了擴繁生根，對根系數量進行統計(圖9)后發(fā)現，3個轉基因株系單株不定根的主根數目顯著高于未轉基因的對照GL-3，轉基因株系單株不定根上的側根以及整個不定根的數目極顯著多于對照。

顯著性分析選擇雙側t分布檢驗：*.P<0.05；**.P<0.01Statistical significance was determined by a two-sided t-test: *.P<0.05；**.P<0.01圖9 MdHYL1過量表達轉基因蘋果苗的根系數目Fig.9 Number of roots in MdHYL1 overexpression transgenic apple lines

對根系生長情況進行觀察也發(fā)現，生根45 d后，轉基因株系與對照相比根系發(fā)育明顯發(fā)達，根系生長健壯且根系數目明顯較多(圖10)。

圖10 MdHYL1過量表達轉基因蘋果苗的根系生長情況Fig.10 Root growth of MdHYL1 overexpression transgenic apple lines

MdHYL1基因在干旱下的表達量顯著上調，且過量表達MdHYL1后轉基因株系根系明顯發(fā)達，而根系越發(fā)達則蘋果抗旱能力越強，這些結果表明MdHYL1基因可能在蘋果響應干旱的過程中發(fā)揮了重要作用。

3 結論與討論

本研究以金冠蘋果葉片cDNA為模板，通過PCR克隆得到MdHYL1基因，這也是該基因首次從金冠蘋果中被克隆到。對MdHYL1蛋白進行系統進化分析，揭示出其在進化上的來源與薔薇科的植物最為相近，與模式植物擬南芥和水稻則非常遠。組織特異表達分析結果表明，該基因在蘋果各個器官和組織中均有表達，表達量為葉>莖>花>根>果實。

通過構建MdHYL1基因的植物過量表達載體，成功轉化蘋果GL-3并獲得3個轉基因株系。測定MdHYL1基因在干旱脅迫下的表達情況發(fā)現，MdHYL1基因在干旱處理后表達量最大為未處理蘋果株系的8.82倍，表明MdHYL1基因在干旱條件下被誘導表達，說明其在植物抗旱中具有重要作用。而在本實驗室前期的研究中，通過對干旱處理下轉基因蘋果株系凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率和瞬時水分利用效率等生理參數的測定及存活率的統計，發(fā)現MdHYL1轉基因蘋果株系的抗旱能力顯著增強(另文發(fā)表)，再次證明了MdHYL1基因在干旱脅迫下起重要作用。進一步對轉基因蘋果表型進行觀察，發(fā)現MdHYL1轉基因蘋果根系較未轉基因的對照顯著增多，而根系的發(fā)育與植物的抗旱能力具有明顯的相關性，根系生長越茂盛則植株的抗旱能力越強，因此推測MdHYL1基因對于干旱的響應主要是通過促進根系的生長實現的。

由各個物種HYL1蛋白的序列比對結果發(fā)現，HYL1蛋白在各物種中N端都比較保守，尤其是兩個雙鏈RNA結合結構域DSRM，表明HYL1參與的miRNA合成過程中，結合雙鏈RNA的特性在各個物種中都是比較穩(wěn)定的。在擬南芥中，HYL1參與了miRNA介導的各生理過程，從最初發(fā)現與miRNA合成直接相關[14]，到發(fā)現在miRNA合成過程中是通過與DCL1[15-17]、HEN1[18-19]、SE[20-21]、RCF3[22]等互作形成復合物來發(fā)揮作用，HYL1在miRNA合成過程中的功能研究已經非常成熟。除了直接參與miRNA的合成及響應IAA、CTK和ABA[6,23]等植物生長激素的調節(jié)過程外，HYL1還參與了miRNA介導的生理反應，如HYL1基因可以調控miR156的靶基因SPL基因的表達水平，從而調控miR156介導的擬南芥童期的營養(yǎng)生長過程[24]；此外，它還參與了miRNA介導的內源小孢子囊和雌蕊結構的調控[25]、葉片近軸和遠軸同一性的平衡[26]及氣孔數目建成等生理過程[27]。以上研究表明，HYL1通過調控miRNA的合成來參與各個生理過程。因此，蘋果MdHYL1基因在干旱中的功能可能也是由某種miRNA介導的生理過程，這為進一步研究干旱過程中相關miRNA的變化提供了依據。