海洋弧菌中褐藻膠裂解酶Alg的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

李云濤,張 齊,汪立平,2*,黃宇良

1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306

2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,食品熱加工工程技術(shù)研究中心,上海 201306

褐藻作為豐富的海洋藻類資源之一，其年產(chǎn)量僅次于纖維素[1]，隨著海洋大型野生藻類的培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，可作為可持續(xù)發(fā)展資源的應(yīng)用開發(fā)提供保障，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)報道[2]，從馬尾藻中可以提取超過30%～35%的褐藻膠，經(jīng)過降解處理后可產(chǎn)生具有較強(qiáng)的生物活性作用的褐藻寡糖，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品保健[3,4]，醫(yī)療醫(yī)藥[5,6]，農(nóng)業(yè)化工[7-10]、生物原料[11]以及飼料添加劑[12]等行業(yè)中，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是通過傳統(tǒng)降解法制備褐藻寡糖具有低效率，反應(yīng)條件劇烈，易腐蝕設(shè)備，造成環(huán)境污染，制備的褐藻膠寡糖產(chǎn)量低且對其活性破壞大，同時還會產(chǎn)生鹽不利于后面的分離純化和分析，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。褐藻膠裂解酶作為褐藻膠降解的關(guān)鍵酶，因其反應(yīng)條件溫和，底物專一性高，反應(yīng)易于控制，生產(chǎn)效率高，副產(chǎn)物少，對環(huán)境友好等優(yōu)勢逐漸成為科研工作者關(guān)注的焦點，對多功能的褐藻膠裂解酶的開發(fā)具有很高的研究價值。

褐藻膠裂解酶來源廣泛，當(dāng)前的酶主要來源于海洋微生物、土壤微生物、部分海洋動植物以及少量的病毒中，但大部分來源的產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株產(chǎn)酶產(chǎn)酶周期長，含量少，從而無法實現(xiàn)大批量獲得褐藻膠裂解酶應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，采用基因工程手段及生物信息學(xué)手段分析褐藻膠裂解酶蛋白結(jié)構(gòu)特性以便對酶蛋白進(jìn)行修飾以及將褐藻膠裂解酶基因進(jìn)行克隆與高效表達(dá)，是開發(fā)高效褐藻膠裂解酶的有效手段[13,14]。

實驗通過研究來源于海洋弧菌Vibriosp.SS-1褐藻膠裂解酶基因Alg在大腸桿菌E.coliBL21(DE5α)中的異源表達(dá)，對褐藻膠裂解酶基因推斷的重組蛋白分子特性為后續(xù)蛋白分子修飾提供理論基礎(chǔ)，實驗還將得到的純的重組酶并深入研究酶學(xué)性質(zhì)，從而確定重組酶的有效應(yīng)用條件，試圖探索分子特性與其酶學(xué)性質(zhì)之間的聯(lián)系，為研究高效褐藻膠裂解酶提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 海洋弧菌（Vibriosp.SS-1）菌株：由本實驗室從上海市蘆潮港水產(chǎn)交易市場（30°51'52.17"N，121°51'26.20"E）購買的鮑魚腸道中篩選得到并保存；

克隆載體pEASY-T3 Cloning Kit及感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1(DH5α)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pET28a(+)、宿主菌株E.coliTop10和表達(dá)菌株E.coliBL21(DE5α)由實驗室保存。

1.1.2 儀器和試劑 GHP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；pHS-3C型pH計，上海精密儀器有限公司；A300型梯度PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司（LongGene）；H2050型冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-2000型紫外分光光度計，美國UNICO公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶購自TaKaRa公司；X-gal、IPTG、氨芐青霉素（Amp）、卡拉霉素（Kan）、蛋白質(zhì)Maker購自生工生物（上海）工程有限公司；海藻酸鈉及其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純試劑，購自上海國藥集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，加蒸餾水至1 L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至7.2左右。固體培養(yǎng)基添加1.2%～1.5%的瓊脂粉。

1.2 實驗方法

1.2.1 海洋弧菌總DNA的提取 按照生工生物（上海）技術(shù)有限公司提供的細(xì)菌總DNA提取試劑盒操作說明，抽提海洋弧菌總DNA，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計及海洋弧菌Alg基因的克隆 上游引物序列為Alg-F：5'-GCG AAG CTT TTAATAATT CTC TCAAAC G-3'，下游引物序列為Alg-R：5'-CG CCATGG AGG GAT GGAATA GAAATG ATA G-3'，其中上下游引物中分別引入HindIII和NcoI作為酶切位點。以海洋弧菌基因總DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系為50 μL，設(shè)計反應(yīng)：2*Taq mix 25 μL，總DNA 模板2 μL，Alg-F 2 μL，Alg-R 2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，將PCR產(chǎn)物-20℃保存并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證，割膠回收目的片段。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將得到的目的Alg基因與表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)同時經(jīng)HindIII和NcoI雙酶切，割膠回收目的片段及酶切質(zhì)粒，以T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Alg，通過熱激法（42℃，30 s）轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌TOP10中進(jìn)行高拷貝復(fù)制，提取重組質(zhì)粒以同樣的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入到表達(dá)宿主細(xì)胞中構(gòu)建工程菌株E.coliBL21(DE5α)，均勻涂布于含X-gal與IPTG的抗性平板上進(jìn)行篩選，挑取挑取陽性克隆菌株接種于含Kan（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行雙酶切鑒定并送生工生物（上海）工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將含重組質(zhì)粒的工程菌分別按1%接種量接種于5 mL含50 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。取2.5 mL過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到250 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8時，取1 mL菌液做未誘導(dǎo)對照；剩余培養(yǎng)液中加入IPTG至終濃度1 mmol/L，28℃，180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集發(fā)酵液。

將發(fā)酵液于4℃，12000 r/min條件下離心30 min，分別收集得到發(fā)酵上清及菌體沉淀。上清液經(jīng)硫酸銨沉淀除去雜蛋白，并通過膜透析除去鹽離子，將粗純化后的發(fā)酵上清液A于-20℃保存；所得的菌體沉淀重懸于50 mmol/L的PBS緩沖液中，參照石榮蓮等[15]方法，以功率150 W，工作/間隙時間為4 s/8 s超聲破碎15 min，破碎液經(jīng)12000 r/min，4℃條件下離心30 min，分別收集上清B及沉淀C。由于重組的褐藻膠裂解酶蛋白中含有組氨酸標(biāo)記的His標(biāo)簽，能與Ni-NTAresin柱上的Ni+親和吸附，利用不同濃度的洗脫緩沖液可將重組褐藻膠裂解酶蛋白進(jìn)一步純化，將收集后的蛋白加入到復(fù)性緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5 mmol/L reduced glutathione，1 mmol/L oxidized glutathione）中進(jìn)行復(fù)性，最后通過膜透析除去鹽離子，得到純度較高的重組酶蛋白，以SDS-PAG凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量測定 以牛血清白蛋白配置蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用改良Lowry法[16]蛋白質(zhì)含量測定。

1.2.6 酶活力的測定 褐藻膠裂解酶能作用于褐藻膠產(chǎn)生不飽和低聚糖醛酸在235 nm條件下有強(qiáng)烈吸收峰，可以依據(jù)吸光值大小來確定酶活力[17]。取0.1 mL純化后的重組酶液與2.9 mL質(zhì)量濃度0.2%海藻酸鈉溶液（0.05 mol/L Tris-HCL緩沖液配置，pH 7.2）混合均勻，30℃水浴反應(yīng)20 min后，以滅活的重組酶液添加相同體積的反應(yīng)底物作為空白對照，設(shè)置3組平行實驗，用紫外分光光度計于235 nm波長條件下測定其吸光值。

酶活定義：1 mL酶液在30℃恒溫條件下，每分鐘裂解海藻酸鈉反應(yīng)底物，使其吸光度值增加0.01為一個酶活單位（U）。

1.2.7 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.7.1 pH值對重組褐藻膠裂解酶活性的影響 在不同pH反應(yīng)條件下測定重組褐藻膠裂解酶的活力；將重組褐藻膠裂解酶在相同溫度的不同pH值的緩沖液中保溫2 h，檢測剩余酶活力大小。每組實驗均設(shè)置3組平行，下同。

1.2.7.2 溫度對重組褐藻膠裂解酶活性的影響 在不同溫度條件下測定重組褐藻膠裂解酶的酶活力；將重組褐藻膠裂解酶在相同pH值的不同溫度下分別保溫2 h，檢測剩余相對酶活力大小。

1.2.7.3 金屬離子對重組褐藻膠裂解酶活性的影響 將不同的金屬離子、EDTA及表面活性劑加入純化的酶液中至終濃度為1 mmol/L，30℃條件下反應(yīng)20 min，測定其相對酶活力大小。

1.2.7.4 重組褐藻膠裂解酶底物特異性研究 分別取2.9 mL不同酶反應(yīng)底物（Tris-HCl緩沖液pH 8.6，0.2%褐藻酸鈉；0.2%聚甘露糖醛酸與古羅糖醛酸混合片段poly(MG)；0.2%聚甘露糖醛酸poly(M)；0.2%聚古羅糖醛酸poly(G)于試管中，加入0.1 mL純化后的重組褐藻膠裂解酶，以高溫滅活的酶做空白對照，使總體系為3 mL于30℃水浴反應(yīng)20 min，在波長235 nm下測定其相對酶活力大小。

1.2.7.5 重組褐藻膠裂解酶動力學(xué)研究 取干凈的試管中加入0.1 mL純化后的重組褐藻膠裂解酶液，再分別加入0.9 mL不同濃度（w/v）（0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.6%）的褐藻酸鈉。于30℃反應(yīng)20 min，再分別在測定紫外波長235 nm條件下反應(yīng)前后的吸光值。以反應(yīng)速率1/[V]作為縱坐標(biāo)，以底物濃度1/[S]為橫坐標(biāo)作Lineweaver-Burk圖。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk)，可以通過橫截距和縱截距以及曲線斜率求出米氏常數(shù)方程Km和Vmax值大小。

1.2.7.6 重組酶對多糖降解產(chǎn)物分析 為了確定重組褐藻膠裂解酶降解產(chǎn)物的組分，將聚甘露糖醛酸poly(M)經(jīng)過重組酶的充分降解后，通過出去產(chǎn)物中鹽離子及雜蛋白，經(jīng)過低溫濃縮干燥溶解于甲醇溶液中，參照Zhu Benwei[18]實驗方法，利用電離噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）對降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.3 褐藻膠裂解酶結(jié)構(gòu)特性分析

依照2016年，韓偉等[19]方法，預(yù)測重組褐藻膠裂解酶的蛋白質(zhì)分子量、等電點及氨基酸所占百分比，并在線模擬重組褐藻膠裂解酶蛋白空間結(jié)構(gòu)，對其理化性質(zhì)的分析提供依據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 海洋弧菌褐藻膠裂解酶基因Alg的克隆

以海洋弧菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增出海洋弧菌褐藻膠裂解酶基因Alg的全長序列，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小約為1.1 kb左右。通過送樣測序得到基因序列長度1032 bp，與凝膠圖像結(jié)果相一致（見圖1）。

圖1 海洋弧菌褐藻膠裂解酶基因Alg的克隆電泳圖Fig.1 Clone electrophoretogram of marine vibrio alginate lyase gene Alg

2.2 重組質(zhì)粒pET28a(+)-Alg的雙酶切鑒定

提取工程菌株的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過HindIII和NcoI雙酶切后，將雙酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳鑒定結(jié)果與理論值相符（見圖2），測序結(jié)果表明插入片段在pET28a(+)中存在正確的開放閱讀框，說明表達(dá)載體pET28a(+)-Alg成功構(gòu)建完成。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a(+)-Alg的雙酶切和PCR鑒定Fig.2 Double-enzyme digestion and PCR identification of recombinant plasmid pET28a()–Alg

2.4 重組褐藻膠裂解酶誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化

含重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Alg的大腸桿菌BL21(DE5α)在37℃，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，成功表達(dá)了重組蛋白Alg。經(jīng)細(xì)胞破碎后通過SDS-PAGE凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在與菌體內(nèi)以包涵體形式存在，通過超聲破碎溶解經(jīng)Ni-NTAresin柱純化后，得到純的重組褐藻膠裂解酶蛋白，將所得重組蛋白逐滴加入到10 mL復(fù)性緩沖液中使其終濃度為20 μg/mL，并在4℃低溫下不停攪拌24 h后，通過膜透析12 h，收集透析后的蛋白液即為純化后的重組蛋白，用于SDS-PAGE凝膠電泳檢測?？梢钥闯鲋亟M蛋白分子量大約38.0 kD，與預(yù)期的分子量相一致（見圖3）。與野生型菌株相比較，重組工程菌E.coliBL21(DE5α)/pET28a(+)-Alg產(chǎn)酶量極大增加，得到的酶蛋白純度提高了近51.01倍，測定其酶活力達(dá)187.5 U/mL，比酶活力為138.9 U/mg，因此也驗證了所得的PCR產(chǎn)物為褐藻膠裂解蛋白的成熟編碼序列（見表1）。

圖3 重組褐藻膠裂解酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化后SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.3 Induced expression of recombinant alginate lyase and purified SDS-PAGE gel electrophoretic diagram

表1 重組蛋白分離純化步驟Table 1 The procedure for recombinant alginate lyase purification

2.5 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 重組酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性 在相同溫度不同pH條件下，測定重組褐藻膠裂解酶的活力，如圖4(A)所示，其最適pH值為8.0左右，適應(yīng)在偏堿性環(huán)境。將重組褐藻膠裂解酶在不同pH緩沖液中進(jìn)行保溫實驗，檢測剩余酶活力，如圖4(B)，發(fā)現(xiàn)該酶在pH在4.0～9.0之間保溫2 h后相對酶活力仍保留在60%以上，具有很強(qiáng)的pH適應(yīng)性。

圖4 pH值對重組酶活力（A）及穩(wěn)定性（B）的影響Fig.4 Effect of pH on activity(A)and stability(B)of the recombinant enzyme

2.5.2 重組酶最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 在不同溫度條件下測定褐藻膠裂解酶活力，發(fā)現(xiàn)該酶最適反應(yīng)溫度為30℃，溫度在50℃以上，基本喪失了酶活力，實驗結(jié)果如圖5(C)所示。將重組褐藻膠裂解酶分別在不同溫度下保溫2 h，檢測剩余酶活力，結(jié)果如圖5(D)所示。結(jié)果表明重組褐藻膠裂解酶在40℃以上條件下保溫，其酶活力急劇下降，損失了60%以上，熱穩(wěn)定性較差。

圖5 pH值對重組酶活力（C）及穩(wěn)定性（D）的影響Fig.5 Effect of pH value on activity(C)and stability(D)the recombinant alginate lyase

2.5.3 金屬離子及表面活性劑對重組酶活性的影響 通過測定不同金屬離子對重組酶活力的影響。當(dāng)離子濃度為1 mmol/L時，K+、Na+、Mg2+等離子對重組酶具有明顯的促進(jìn)作用，酶活力提升了近30%；相反Cu2+、Fe3+、Ba2+、Fe2+、Al3+、SDS、EDTA等離子及表面活性劑對重組酶的抑制作用較明顯，其中SDS幾乎使得重組酶活性喪失（見表2）。

表2 金屬離子對重組褐藻膠裂解酶活性的影響Table 2 Effect of metal ions on the activity of recombinant alginate lyase

2.5.4 重組褐藻膠裂解酶底物特異性研究 可以看出重組褐藻膠裂解酶對不同底物的褐藻膠產(chǎn)生褐藻膠寡糖能力有明顯的差異性，特別是對聚甘露糖醛酸poly(M)、褐藻酸鈉有明顯的降解作用，其中對poly(M)底物特異性作用最顯著，而在底物為聚古羅糖醛酸poly(G)片段中水解產(chǎn)生寡糖能力較弱，表明該重組酶可以作為一種底物偏好型的雙功能酶，應(yīng)用于寡糖制備工藝中（見表3）。

表3 重組酶的底物特異性研究Table 3 Study on the substrate specificity of recombinant enzyme

2.5.5 重組褐藻膠裂解酶動力學(xué)方程 以反應(yīng)速率1/[V]作為縱坐標(biāo)，以底物濃度1/[S]為橫坐標(biāo)作Lineweaver-Burk圖，通過橫截距和縱截距以及曲線斜率測得重組酶米氏常數(shù)Km為5.93 mg/mL，Vmax值為 826.44 mg/(mL·min)（見圖6）。

圖6 重組酶Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.6 Lineweaver-Burk double reciprocals of recombinase

2.5.6 重組褐藻膠裂解酶對多糖降解產(chǎn)物分析 利用電離噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）進(jìn)行分析，根據(jù)物質(zhì)的質(zhì)荷比不同，確定出主要峰值371.69 m/z(DP2)、549.28 m/z(DP3)、734.51 m/z(DP4)和923.59 m/z(DP5)分別對應(yīng)著不飽和二糖、三糖、四糖和五糖，對于聚甘露糖醛酸poly(M)的降解產(chǎn)物出現(xiàn)的單糖，其中以DP2（二糖）的含量最高，是其重組酶降解的主要產(chǎn)物，可應(yīng)用于褐藻寡糖的功能性研究（見圖7）。

圖7 重組褐藻膠裂解酶降解poly(M)的產(chǎn)物ESI-MS分析Fig.7 ESI-MS analysis of poly(M)products degraded by recombinant alginate lyase

2.6 褐藻膠裂解酶蛋白分子分析

采用ProtParam對褐藻膠裂解酶的氨基酸組成及理化性質(zhì)分析可知，海洋弧菌SS-1褐藻膠裂解酶蛋白的編碼氨基酸為344個，分子量約為38.2 kD，等電點pI為5.08，其中帶負(fù)電荷氨基酸Asp和Glu總個數(shù)為51，帶正電荷的氨基酸Arg和Lys的總個數(shù)為36，各氨基酸含量，由此可以推斷該重組酶為一種堿性蛋白酶，這與重組酶理化特性相一致（見表4）。

為了更深入了解重組酶的理化特性，利用SWISS-MODEL在線工具模擬了重組酶的空間三維結(jié)構(gòu)圖，以4dvj.1.A為模板，可知該重組蛋白酶為一種同源性為51.08%的低聚集單鏈蛋白分子，其中由大部分的不規(guī)則線性卷曲（約占44%）及少量的α-螺旋（約占27%）和β-折疊（約占27%）相互分散排列，導(dǎo)致重組酶理化性質(zhì)較差，并由酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了驗證（見圖8）。

表4 推導(dǎo)出的堿性重組酶的各氨基酸含量Table 4 Deduced amino acid content of alkaline recombinase

圖8 重組褐藻膠裂解酶的三維模型預(yù)測Fig.8 Prediction for recombinant alginate lyase by 3D model

3 討 論

褐藻膠裂解酶是以海洋褐藻類中所含褐藻膠為底物制備具有多功能活性低聚褐藻寡糖的關(guān)鍵酶，對海藻資源的開發(fā)利用及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，通過對褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)及降解產(chǎn)物深入分析，為實現(xiàn)酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。目前，關(guān)于實現(xiàn)褐藻膠裂解酶的異源表達(dá)的報道較多[14,19-22]，與野生型篩選得到的產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株相比，采用基因工程技術(shù)手段得到重組菌株在蛋白表達(dá)水平及酶分離純化上均具有絕對的優(yōu)勢。

本文通過雙酶切構(gòu)建重組工程菌株E.coliBL21(DE5α)/pET28a(+)-Alg，純化倍數(shù)達(dá)到51.01倍，純酶回收率近26%，測定其酶活力達(dá)187.5 U/mL，比酶活力為138.9 U/mg。與王瑩等[23]相比，該在酶活力上具有明顯優(yōu)勢，可以很好應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該重組酶最適反應(yīng)pH 8.0，為一種堿性蛋白酶，且pH穩(wěn)定性好，在pH為4.0～9.0范圍內(nèi)能保持較高的酶活力。酶的最適反應(yīng)溫度為30℃，穩(wěn)定性相對較差，對離子反應(yīng)敏感。與已報道的重組酶相比[20-21]，該重組酶的最適反應(yīng)溫度更低，屬于典型低溫酶的特點，依據(jù)其熱不穩(wěn)定性的特點，在后續(xù)工業(yè)生產(chǎn)通過高溫進(jìn)行選擇性滅活。

通過對重組酶的構(gòu)效關(guān)系研究和降解產(chǎn)物的研究，為實現(xiàn)褐藻膠裂解酶向商業(yè)酶轉(zhuǎn)化并大量應(yīng)用于工業(yè)中奠定重要的研究基礎(chǔ)。酶動力學(xué)方程為褐藻膠裂解酶的酶降解過程提供技術(shù)參數(shù)。底物特異性表明該重組酶具有有效降解poly(M)的雙功能酶，可以有效降解褐藻膠為褐藻寡糖，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)中。如2016年，潘金路等[12]在飼料中添加褐藻寡糖喂食大菱鲆可以有效改善其腸道杯狀細(xì)胞，促進(jìn)腸道脂肪酶活性。2016年，李麗妍等[24]褐藻寡糖能提高小鼠的抗熱應(yīng)激能力，表明褐藻寡糖潛在的應(yīng)用價值。

隨著褐藻膠裂解酶研究的不斷深入，更多潛在的價值也會被不斷發(fā)掘，該研究為褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)分析提供了很好的技術(shù)基礎(chǔ)，為褐藻寡糖的制備提供了好的酶資源。

4 結(jié) 論

以產(chǎn)褐藻膠裂解酶的海洋弧菌Vibriosp.SS-1為模板，通過基因工程手段擴(kuò)增得到褐藻膠裂解酶基因Alg，構(gòu)建重組工程菌株E.coliBL21(DE5α)/pET28a(+)-Alg，經(jīng)1 mmol/L濃度的IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，能最大量獲得重組褐藻膠裂解酶，由Ni-NTAresin柱純化后，純化倍數(shù)達(dá)到51.01倍，純酶回收率近26%，測定其酶活力達(dá)187.5 U/mL，比酶活力為138.9 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該重組酶最適反應(yīng)pH 8.0，為一種堿性蛋白酶，且pH穩(wěn)定性好，在pH為4.0～9.0范圍內(nèi)能保持較高的酶活力。酶的最適反應(yīng)溫度為30℃，穩(wěn)定性相對較差，屬于典型低溫酶的特點。金屬離子對重組酶的酶活性影響較大，其中K+、Na+、Mg2+等顯示出對重組酶有明顯的促進(jìn)作用，Cu2+、Fe3+、Ba2+、Fe2+、Al3+、SDS、EDTA等離子對該酶抑制作用明顯。酶動力學(xué)參數(shù)Km為5.93 mg/mL，Vmax為826.44 mg/(mL·min)；電離噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）分析其降解褐藻膠產(chǎn)物主要為二糖，可用于褐藻寡糖制備。