吡咯烷二硫代氨基甲酸酯治療急性胰腺炎大鼠的效果及其作用機制

王艷娥

(武漢市中心醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

重癥急性胰腺炎(SAP)病理過程開始于胰腺腺泡細(xì)胞的破壞，細(xì)胞因子學(xué)說認(rèn)為胰腺腺泡細(xì)胞被破壞后，病變處細(xì)胞因子大量釋放，進(jìn)入體循環(huán)，進(jìn)而誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征〔1〕。研究〔2〕發(fā)現(xiàn)左旋精氨酸誘導(dǎo)的急性胰腺炎(AP)發(fā)病機制與核因子(NF)-κB活化、氧化應(yīng)激有關(guān)。 NF-κB活化發(fā)生核移位與相應(yīng)靶 DNA結(jié)合誘導(dǎo)，從而加重胰腺炎的臨床癥狀。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)是一種重要的抗氧化劑，可通過抑制NF-κB通路抑制κB蛋白降解，進(jìn)而達(dá)到阻止NF-κB活化核移位過程〔3〕。研究〔4〕發(fā)現(xiàn)重要的晚期炎癥因子參與了膿毒癥的病理過程，并且有望成為治療SAP的新靶點； 高遷移率蛋白(HMG)B1是一類被證實與SAP具有重要關(guān)系的非組核蛋白，但相關(guān)機制還不明晰。本研究探討PDTC治療AP大鼠的效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取SPF級SD大鼠72只，雌雄不限，平均(210±6.4)g，喂養(yǎng)于23～25℃、光照12 h、相對濕度45%～60%的環(huán)境中，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2實驗藥品、儀器 PDTC、5%牛黃膽酸鈉購于Sigma公司；NF-κB、HMGB1一抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購于南京建成生物研究所；Western裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于南京凱基藥物有限公司；酶標(biāo)儀購于美國BD公司。

1.3實驗分組與造模 SPF級SD大鼠72只隨機分為假手術(shù)組、模型組、PDTC組各24只，術(shù)前12 h禁食，腹腔注射2%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉；以上腹正中為切口，5號皮試針于十二指腸乳頭附近腸壁上戳一小孔，改用另5號皮試針置入腸腔，經(jīng)乳頭探入膽胰管內(nèi)，用顯微血管夾分別夾閉肝門部膽管和膽胰管穿刺針處；勻速0.05 ml/min注射5%牛黃膽酸鈉1 ml/kg，見胰腺組織充血水腫、點片狀出血后，撤血管夾，縫合腸壁穿刺孔，關(guān)腹。術(shù)后皮下注射生理鹽水20 ml/kg復(fù)蘇、分籠安置。假手術(shù)組只行經(jīng)乳頭膽胰管穿刺而不注射任何藥物〔5〕。

1.4干預(yù)方法 PDTC組于建模前腹腔注射30 mg/kg的PDTC，假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.5胰腺組織HE染色 取各組胰腺組織，10%甲醛固定過夜，脫水后石蠟包埋并切片，脫蠟后梯度酒精脫水、蘇木素-伊紅染色，晾干、樹膠封片，顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)情況〔6〕。

1.6ELISA法 大鼠心臟取血3 ml，離心后分離血清，酶標(biāo)儀ELISA法檢測丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素(IL)-1、淀粉酶(AMY)水平，實驗操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.7Western印跡法 蛋白裂解液提取胰腺組織核蛋白以檢測NF-κB活性；蛋白裂解液提取胰腺總蛋白以檢測HMGB1水平；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)至PAGE膜并用5%脫脂牛奶室溫2 h封閉，分別加入一抗后4℃過夜，次日Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗5次后滴加羊抗兔二抗1 h室溫孵育后ECL化學(xué)顯影〔7〕。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組胰腺組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組可見胰腺組織結(jié)構(gòu)清楚、未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞、炎癥細(xì)胞浸潤等；模型組胰腺組織水腫明顯，小葉間隙增大，胰腺組織中存在大量的紅色滲出物，腺泡腫脹，鏡下檢查可見壞死病灶，壞死病灶區(qū)域內(nèi)腺泡結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核發(fā)生凝固、壞死、溶解、細(xì)胞膜破裂；PDTC組胰腺組織的病變程度較模型組病變更輕，但是較假手術(shù)組顯著加重。見圖1。

2.2各組血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平比較 造模后24、48及72 h，模型組、PDTC組血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC組血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平均顯著低于模型組(P<0.05)；見表1。

圖1 各組胰腺組織HE染色情況(HE，×400)

指標(biāo)組別24 h48 h72 hHMGB1(μg/ml)假手術(shù)組1.21±0.201.26±0.191.23±0.23模型組2.67±0.771)3.81±0.931)3.92±0.871)PDTC組1.63±0.341)2)1.78±0.501)2)1.94±0.481)2)MDA(nmol/ml)假手術(shù)組11.42±2.0111.85±1.9311.62±2.20模型組32.72±5.591)36.81±6.201)39.94±5.131)PDTC組22.18±4.201)2)25.94±5.771)2)20.76±5.381)2)IL-1(ng/ml)假手術(shù)組258.2±38.6262.7±41.9256.1±43.0模型組596.8±94.21)941.6±148.61)990.8±159.31)PDTC組392.1±77.61)2)438.2±89.51)2)411.3±73.41)2)AMY(U/L)假手術(shù)組114.3±18.4116.0±21.5117.2±19.5模型組339.2±59.11)287.6±52.81)238.6±42.51)PDTC組244.6±41.41)2)195.0±38.71)2)169.2±33.51)2)

1)與假手術(shù)組比較，2)與模型組比較：均P<0.05；下表同

2.3各組胰腺組織中NF-κB蛋白相對表達(dá)強度比較 造模后24、48及72 h，模型組和PDTC組胰腺組織中NF-κB蛋白相對表達(dá)強度均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC組胰腺組織中NF-κB蛋白相對表達(dá)強度均顯著低于模型組(P<0.05)；見表2。

表2 各組造模后不同時間胰腺組織中NF-κB蛋白相對表達(dá)強度比較

2.4各組胰腺組織中HMGB1蛋白相對表達(dá)強度比較 造模后24、48及72 h，模型組、PDTC組胰腺組織中HMGB1蛋白相對表達(dá)強度均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC組胰腺組織中HMGB1蛋白相對表達(dá)強度均顯著低于模型組(P<0.05)；見表3。

表3 各組造模后不同時間胰腺組織中HMGB1蛋白相對表達(dá)強度比較

3 討 論

AP約20%可發(fā)展為SAP，而SAP并發(fā)癥較多、病情兇險并具有較高的病死率，相關(guān)統(tǒng)計〔8〕顯示目前SAP的總體病死率可達(dá)21%～35%?，F(xiàn)階段SAP伴多器官功能損傷的機制尚不明晰，研究〔9〕發(fā)現(xiàn)HMGB1在SAP大鼠中呈現(xiàn)高表達(dá)，并認(rèn)為SAP的發(fā)生、發(fā)展可能存在HMGB1的參與。HMGB1由巨噬細(xì)胞分泌，是一類廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非組核蛋白，其可作為晚期炎癥介質(zhì)參與膿毒癥的病理過程，并預(yù)測HMGB1有望成為治療SAP的新靶點。經(jīng)過資料〔10，11〕總結(jié)認(rèn)為HMGB1參與炎癥反應(yīng)主要有以下5種機制：①HMGB1能刺激單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表達(dá)釋放多種炎癥因子；②HMGB1的自身毒性作用；③HMGB1與其他炎癥因子的相互促進(jìn)作用；④HMGB1能增加上皮細(xì)胞的通透性；⑤HMGB1能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，并破壞其屏障功能。

NF-κB是一類能與多種基因啟動子部位的κB位點發(fā)生特異性結(jié)合的結(jié)合蛋白總稱，亦是一類促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的DNA。 研究〔12〕發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1等與SAP病程密切相關(guān)的炎癥因子的基因啟動部位均含有NF-κB位點，故而NF-κB對TNF-α的基因蛋白表達(dá)具有調(diào)控作用。但目前HMGB1基因啟動子上是否存在κB的結(jié)合位點還不確定。故而，還無法肯定κB是否能調(diào)控HMGB1的表達(dá)。

本研究結(jié)果提示PDTC治療AP大鼠能顯著減輕炎癥反應(yīng)程度。這可能是因為PDTC抑制AP大鼠胰腺NF-κB的活化，進(jìn)而降低了AP大鼠炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)和組織損傷。

本研究結(jié)果提示PDTC治療AP大鼠能夠降低胰腺組織中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白表達(dá)。PDTC是一種含SH的強抗氧化劑，其容易進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)去乙?；笊砂腚装彼徇_(dá)到抗氧化作用〔13，14〕。PDTC抑制NF-κB活化的機制主要通過降低脂質(zhì)過氧化物酶的活化，減少NF-κB抑制蛋白降解，從而抑制NF-κB活化；通過與巰基結(jié)合，降低NF-κB的DNA結(jié)合活性，從而降低胰腺組織中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)程度，起到保護(hù)胰腺的作用〔15〕。