參芍膠囊對心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應的影響

趙桂峰 黃欣瑋 毛靜遠 吳麗玉

(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科，天津 300193)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)指缺血心肌組織在血液重新灌流后，出現(xiàn)細胞代謝功能障礙或結構破壞反而加重的現(xiàn)象。炎癥反應是MIRI重要機制之一。再灌注后中性粒細胞(PMNs)浸潤、聚集，釋放細胞炎癥因子、氧自由基，導致細胞損傷。參芍膠囊由人參莖葉皂甙和白芍制成的中成藥制劑，是治療冠心病的國家中藥保護品種。本研究探討參藥膠囊及有效成分對MIRI大鼠PMNs浸潤和炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年健康的雄性Wistar大鼠，體重250～300 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔許可證號：SCXK(京)2012-0001〕。所有大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，具有良好通風和空氣過濾系統(tǒng)，將大鼠按體重編號后，室溫20～25℃，相對濕度40%～60%，給予普通大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，日照采用日光燈12 h開關循環(huán)進行，觀察3 d后進入實驗。

1.2試劑與儀器 參芍膠囊(SS)(由人參莖葉皂甙和白芍組成，保定天浩制藥有限公司提供，批號150701)，人參莖葉總皂苷(TSFG)、白芍浸膏粉(Pae)(保定天浩制藥有限公司提供)，阿托伐他汀(Ator)鈣片(輝瑞制藥有限公司提供，批號L14582，規(guī)格20 mg)，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-10試劑盒(美國Uscn Life science Inc 公司，批號分別為SEA133Ra，SEA563Ra,SEA056Ra)，Spectra Max190型酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.3動物模型制備與評價 各組大鼠于術前禁食12 h，自由飲水，記錄體重，用5%水合氯醛(6 ml/kg)腹腔注射麻醉。2～5 min后，仰臥位固定，消毒左側胸前及腋下皮膚，胸部備皮。記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖。沿左側第3、4肋間(或心臟搏動最明顯處)剪開左胸皮膚約1 cm，用止血鉗逐層分離皮下組織。在心臟搏動最明顯處用彎止血鉗撐開胸廓，將心臟擠出胸腔，持5/0無創(chuàng)縫合針絲線，于肺動脈圓錐與左心耳之間，在離左冠狀動脈前降支起始部約2 mm處進針，深度大約1 mm，在結扎處預先墊一根1/0粗棉線，而后把冠狀動脈及棉線一起進行結扎，第二結為滑結，隨后立即把心臟送回胸腔并排氣凈血，再用直頭止血鉗夾閉皮膚及肌肉層，造成心肌缺血。心電圖示ST段抬高并與T波融合，結扎線下心肌組織發(fā)紺，說明心肌缺血模型成功。30 min后，松開止血鉗，恢復血流灌注，出現(xiàn)再灌注心律失常，標志再灌注成功。見圖1。其中假手術組在左冠狀動脈前降支下只穿線不進行結扎。

圖1 大鼠造模不同時間點心電圖變化

1.4分組與給藥 將70只Wistar大鼠按體重隨機分為假手術組，缺血再灌注(I/R)組，SS 250 mg/kg(SS250)組，SS 500 mg/kg(SS500)組，TSFG組，Pae組和Ator組共7組，每組10只。SS組劑量依據(jù)人與大鼠體表面積換算，用0.9%生理鹽水配制成濃度分別為25 mg/ml和50 mg/ml溶液。每1 000粒SS(0.25 g/粒)中含TSFG 13 g，Pae 185 g。SS 500 mg/kg對應TSFG溶液濃度為2.6 mg/ml，Pae溶液濃度為37 mg/ml。Ator組溶液濃度為1 mg/ml。假手術組和I/R組予等量生理鹽水。預灌胃1 w，每天上午給藥1次，自由飲食飲水。術前1 h末次給藥。

1.5中性粒細胞計數(shù) 將心臟取結扎線下1～2 mm部位，橫切2～3 mm厚度的組織固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片后，每組大鼠各取一張切片，每張切片隨機取3個視野，每組共計觀察6個視野，計算PMNs數(shù)量，然后取其均值。

1.6酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10 左室插管結束后進行大鼠腹主動脈取血6 ml，置于37℃水浴2 h，之后3 000 r/min，15 min進行離心，取上清，分裝后-80℃保存。具體操作按照試劑盒說明書進行。酶標儀在450 nm波長測光密度。以標準品濃度為縱坐標，OD值均值為橫坐標作圖，即得標準曲線，根據(jù)標準曲線計算各樣品濃度。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1心肌組織病理學形態(tài)變化 假手術組可見左室外膜局部區(qū)域心肌細胞輕度水腫，少量炎細胞浸潤；I/R組可見左室大部分區(qū)域心肌細胞重度水腫及大量的炎細胞浸潤，外膜局部區(qū)域可見灶性壞死；SS250組和Pae組左室大部分區(qū)域(1/2以上)中度水腫，炎細胞浸潤，外膜區(qū)域可見散在的灶性壞死；TSFG組左室部分區(qū)域可見輕到中度的心肌細胞水腫，炎細胞中度浸潤；SS500組及Ator組左室心肌細胞水腫程度有所減輕，可見炎細胞浸潤，無灶性壞死。見圖2。

(黑色箭頭:炎細胞浸潤；白色箭頭:細胞水腫)圖2 各組心肌HE染色(×400)

2.2中性粒細胞計數(shù) 與假手術組〔(18.53±0.84)個/視野〕比較，各組MIRI大鼠心肌組織中PMNs數(shù)量顯著升高〔I/R組(33.44±1.22)個/視野、SS250組(18.78±0.84)個/視野、SS500組(19.50±0.69)個/視野、TSFG組(22.33±1.29)個/視野、Pae組(29.33±0.82)個/視野、Ator組(28.60±1.01)個/視野，P<0.01〕。與I/R組比較：用藥各組PMNs數(shù)量顯著減少(P<0.05，P<0.01)。與Pae及Ator比較：SS250組、SS500組和TSFG組PMNs數(shù)量顯著減少(P<0.01)。與TSFG組比較，SS250、SS2500組PMNs數(shù)量顯著減少(P<0.05)。

2.3各組血清中炎癥因子的變化 與假手術組比較，I/R組TNF-α濃度顯著升高(P<0.01)。與I/R組比較，SS250組、SS500組、TSFG組TNF-α濃度明顯降低(P<0.01，P<0.05)。與假手術組比較，I/R組IL-1β濃度明顯升高(P<0.05)。與I/R組比較，SS250 組、SS500組、Pae組和Ator組IL-1β濃度明顯降低(P<0.05)；TSFG組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。用藥組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組比較，I/R組IL-10濃度顯著下降(P<0.01)。與I/R組比較，SS250組、SS500組IL-10濃度明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較

與假手術組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與I/R組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

炎癥反應是介導MIRI的重要機制之一。PMNs在炎癥反應中扮演重要角色。MIRI過程中PMNs被激活并黏附于血管內皮細胞，導致內皮細胞水腫和功能障礙，毛細血管腔堵塞，發(fā)生無復流現(xiàn)象。其中活化的PMNs可誘發(fā)細胞膜磷脂A2釋放大量花生四烯酸，產生炎癥介質〔1〕。其中TNF-α是啟動炎癥級聯(lián)反應的關鍵因素。主要作用有抑制心肌收縮力；誘導多種炎癥因子和黏附分子的產生；誘導心肌細胞凋亡。抑制TNF-α的表達可以減輕MIRI程度。IL-1β是單核巨噬細胞分泌的炎癥因子，廣泛參與機體缺血缺氧、炎癥、應激的調控。其參與MIRI的過程主要作用有介導PMNs與血管內皮細胞黏附因子的表達，促進PMNs的遷移及浸潤，加劇炎癥反應及微血管阻塞；同時與TNF-α具有協(xié)同作用，誘導心肌細胞凋亡，產生心肌毒性作用。所以TNF-α和IL-1β是MIRI發(fā)生時兩種最重要的促炎因子〔2〕。而細胞因子IL-10是由各種淋巴細胞產生炎癥抑制因子。抑制促炎因子的過度表達，在下調炎癥反應，減輕心肌損傷中發(fā)揮關鍵作用。雖然炎癥反應在MIRI過程中會對心臟產生不利的影響。但應用糖皮質激素抑制機體的炎癥反應則不利于心臟組織修復和功能恢復。所以，炎癥是把“雙刃劍”。如何利用中醫(yī)藥的“多靶點，多環(huán)節(jié)”的優(yōu)勢進行干預，雙向調節(jié)，趨利避害，才是中醫(yī)藥防治MIRI的研究重點。目前中醫(yī)藥復方、有效組分等的研究已經顯示了良好的基礎和臨床效果〔3〕。

SS組方精簡，以人參為君藥，益氣養(yǎng)陰；《本經》云：“主補五臟，安精神，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智?！薄端幮哉摗吩疲骸爸魑迮K氣不足，五勞七傷，虛損瘦弱……補五臟六腑，保中守神?！卑咨譃槌妓帲叙鲋雇?，養(yǎng)血和陰?！侗窘洝吩疲何犊?，平，主治邪氣腹痛，除血痹，破堅積……利小便，益氣。兩藥合用,共奏益氣活血，化瘀止痛之功效。

本研究中發(fā)現(xiàn)，SS及其成分均能夠抑制PMNs的浸潤。雖然兩種劑量無統(tǒng)計學差異，但高劑量組顯示更好的作用趨勢。其中，TSFG作用好于Pae，體現(xiàn)方劑中君藥的核心作用。其次，SS具有抑制促炎因子TNF-α、IL-1β，提高抗炎因子IL-10生成的作用，且無劑量依賴性。而Pae和TSFG分別對TNF-α及IL-1β無明顯抑制作用。揭示SS兩種成分分別作用于不同的炎癥因子產生抗感染作用。體現(xiàn)了中醫(yī)藥的多靶點協(xié)同整合作用的優(yōu)勢。再次，SS復方具有促進抗炎因子IL-10產生的作用，而其單一組分卻無明顯作用。進一步揭示SS兩種成分的協(xié)同作用，整體作用是多種成分微作用的整合，是“合力”。但多靶點作用并不是簡單地成分堆積。只有在中醫(yī)理論指導下的方劑配伍才能成為有機的多靶點組合。有效組分的作用機制研究也是中醫(yī)配伍理論科學內涵的研究重點之一。對于該藥的研究必須針對MIRI發(fā)生不同階段的病理生理機制，進一步深入研究其有效組分和干預機制。