硫化氫干預對小鼠心肌纖維化MAPK通路表達的影響

周 茜 張敏芳 任海燕 喬慧瑛

(蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學科,江蘇 蘇州 215200)

心肌纖維化(MF)是指在心肌的正常組織結構中細胞外基質過量積聚，心臟組織中膠原濃度顯著增高導致間質纖維成分增多或心肌細胞死亡從而被纖維組織替代〔1.2〕。硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的氣體，在人體參與調節(jié)機體許多生理和病理過程，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用〔3，4〕。研究顯示H2S可改善大鼠心肌纖維化，減少缺血再灌注相關的心律失常，可見H2S可改善心肌損傷〔5，6〕。心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的過程均與絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活有關，本文探討H2S是否影響心肌纖維化發(fā)生時MAPK通路。

1 材料與方法

1.1受試動物 BALB/c 雌性小鼠，體重18～22 g，6周齡，由新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供。使用實驗動物依照3R原則，處理動物符合動物倫理學要求。

1.2心肌纖維化小鼠模型的制備 取BALB/c 雌性小鼠腹部皮下注射異丙腎上腺素，劑量50 mg/kg，2次/d，連續(xù)10 d。

1.3分組及給藥 取正常BALB/c 雌性小鼠15只，連續(xù)腹部皮下注射生理鹽水10 d，另取45只心肌纖維化小鼠，分為化模型組、H2S高和低劑量組。連續(xù)給藥8 w。

1.4指標檢測

1.4.1體表心電圖 麻醉小鼠，行體表心電圖分析。采用 Nihon Kohden ECG-6511 單道心電圖機(上海光電)接上肢體導聯(lián)，記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖。

1.4.2組織病理學 治療后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠，下腔靜脈取血，分離血清待測。冰上分離心臟，稱重，分2份，1份甲醛固定，石蠟包埋，切片，行HE染色，觀察病理，1份-70℃?zhèn)溆眠M行Western印跡檢測。

1.4.3Western印跡檢測 JNK、ERK、p90RSK和p38磷酸化水平的表達加入1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液低溫裂解5 min，離心得總蛋白。以二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，電泳，上樣，電轉印，PBS-T室溫封閉。應激活化蛋白激酶(JNK)(1∶1 000)、細胞外信號調節(jié)的蛋白激酶(ERK)(1∶1 500)、p90RSK(1∶800)、p38(1∶500)，GAPDH(1∶1 000)為內參；一抗孵育結束后，取出硝酸纖維素膜(NC膜)，放TBST于搖床洗滌，洗完進行二抗(1∶10 000)室溫孵育1.0 h。在暗室中電化學發(fā)光(ECL)顯色，曝光、條帶半定量分析。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行t及χ2檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1各組體重、心臟重量和心臟系數比較 與正常組比較，模型組體重明顯降低(P<0.05)，心臟重量和心臟系數明顯增高(P<0.05)，與模型組比較，H2S組體重明顯增高(P<0.05)，心臟重量降低和心臟系數明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表1。

2.2各組心電圖比較 與正常組比，模型組ST段明顯抬高(P<0.05)，H2S組ST段明顯降低(P<0.05)，見圖1。

2.3各組心肌病理學觀察 正常組心肌細胞正常，模型組心肌細胞肥大、腫脹，變性，部分溶解或壞死，肌原纖維扭曲，斷裂，炎性細胞浸潤。H2S低劑量組大部分病灶均被吸收，少量炎癥細胞浸潤，增生的纖維組織和肌原纖維溶解，H2S高劑量改善明顯，見圖2。

2.4各組心肌JNK表達比較 與正常組比較，模型組JNK明顯增高，與模型組比較，H2S組JNK明顯降低，且呈劑量依賴性，見表2，圖3。

表1 各組體重、心臟重量和心臟系數比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與H2S低劑量組比較：3)P<0.05，下表同

圖1 各組治療心電圖比較

圖2 各組心肌病理學觀察(HE，×200)

組別JNKERKp90RSKp38正常組0.4±0.21.0±0.50.4±0.10.3±0.2模型組0.9±0.21)0.2±0.11)0.3±0.11)0.9±0.21)H2S低劑量組0.5±0.22)0.4±0.12)0.6±0.22)0.6±0.22)H2S高劑量組0.3±0.12)3)0.6±0.22)3)0.9±0.32)3)0.4±0.12)3)F/P值31.923/0.00022.581/0.00028.000/0.00032.308/0.000

2.5各組心肌ERK表達比較 與正常組比較，模型組ERK明顯降低，與模型組比較，H2S組ERK明顯升高，且呈劑量依賴性，見表2，圖4。

2.6各組心肌p90RSK表達比較 與正常組比較，模型組p90RSK明顯降低，與模型組比較，H2S組p90RSK明顯升高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見表2，圖5。

2.7各組心肌p38表達比較 與正常組比較，模型組p38明顯增高，與模型組比較，H2S組的p38明顯降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表2，圖6。

1～4：正常組，模型組，H2S低劑量組，H2S高劑量組，下圖同圖3 各組心肌JNK表達

圖4 各組心肌ERK表達

圖5 各組心肌p90RSK表達

圖6 各組小鼠治療后心肌p38磷酸化表達的比較

3 討 論

心肌纖維化的病理機制較為復雜，涉及多種細胞信號通路引起細胞凋亡，其中MAPK 細胞信號途徑是此過程中誘導心肌細胞損傷致凋亡中的一個重要調節(jié)樞紐，是多種細胞外信號引起細胞增殖、肥大和纖維化的細胞內信息共同通路〔7〕。動物研究也證實心肌纖維大鼠的MAPK活性顯著高于同齡健康大鼠〔8〕。

MAPK通路容易被心肌纖維化、缺血再灌注損傷和細胞因子等刺激性病理因素激活。MAPK分為3 個亞族：ERK、JNK和p38〔9，10〕。其中，ERK 具有心肌保護作用。ERK 過度表達可抑制大鼠的心肌凋亡能力，激活的 ERK 信號級聯(lián)可消除缺血再灌注損傷所致的心肌細胞損傷及凋亡。ERK 的下游效應器承擔ERK的抗凋亡功能，如 ERK 能夠直接磷酸化且激活 p90RSK，激活的 p90RSK能在線粒體順序化磷酸化親凋亡因子 Bad，保護細胞避免凋亡。JNK和p38蛋白激酶被激活后引起特定蛋白的表達或活性改變，參與細胞的基因表達、遷移、分化、凋亡和增殖調控作用，可導致多種器官的細胞凋亡。嚙鼠動物的研究顯示p38在缺血再灌注損傷的心肌細胞促凋亡方面具有關鍵作用，小鼠心肌缺血前給予p38的特異性抑制劑SB239063，可顯著降低心肌梗死面積，但JNK在調節(jié)心肌細胞凋亡的效應仍存在爭議，與JNK可調節(jié)不同細胞因子發(fā)揮促進或抑制細胞凋亡的作用〔11～13〕。由此可見，MAPK 信號轉導途徑的逐級激活可能是血管平滑肌細胞增殖和心肌纖維化的重要機制。

H2S對心肌保護作用受到關注，離體心肌梗死模型的研究顯示，H2S可顯著縮小梗死心肌面積并降低心肌梗死后死亡率，提示H2S可能對缺血缺氧心臟起著保護性作用。H2S對主動脈及肺動脈血管平滑肌細胞具有抑制增殖和促進凋亡的雙重作用。對于體外培養(yǎng)的大鼠主動脈血管平滑肌細胞，內皮素可誘導其增殖并使MAPK活性增加，而H2S可劑量依賴性地下調MAPK從而抑制內皮素誘導的細胞增殖〔14～17〕。

本文顯示，H2S能夠抑制MAPK通路激活，即促進 MAPK的ERK 的活化和減少促凋亡通路JNK和p38通路的激活，起到減輕心肌纖維化的藥效，具有明顯的心肌靶器官保護作用，但課題仍存在一些問題：①JNK的抗心肌細胞凋亡的作用仍處于爭議狀態(tài)，②p38信號通路與細胞外的應激性刺激相關，其中一個因素為高滲，而H2S的干預是否也影響體液滲透壓，這一點本課題并未考察，③H2S的藥理作用是否還涉及其他作用靶點和通路還需進一步研究。