蔬菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性及防病應(yīng)用潛力評估

黃學(xué)屏，宋昱菲，羅健，趙時峰，慕衛(wèi)，劉峰

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點實驗室/山東省高校農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，山東泰安 271018；2莘縣農(nóng)業(yè)局，山東莘縣 252400）

0 引言

【研究意義】菌核病是由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一種世界性植物病害。由于該菌寄主范圍廣，可侵染全球75科270屬的400多種作物，同時能夠產(chǎn)生抗逆能力超強的菌核從而擁有較強的逆境存活力，加之作物抗病品種選育困難等，導(dǎo)致該病呈加重發(fā)展趨勢[1-3]。在我國，菌核病是長江中下游油菜產(chǎn)區(qū)的主要病害[4]；近年來，隨著連作年限的延長，該病在山東部分番茄、茄子、辣椒等設(shè)施蔬菜產(chǎn)區(qū)逐漸成為影響蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害。目前，生產(chǎn)上主要使用殺菌劑防治菌核病，但登記品種少，常用藥劑包括苯并咪唑類（如多菌靈）和二甲酰亞胺類（如菌核凈）等，但由于長期單一使用這些藥劑，病原菌已經(jīng)產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[5-7]，因此亟需篩選新型殺菌劑?！厩叭搜芯窟M展】琥珀酸脫氫酶抑制劑類（SDHI）殺菌劑作用于菌體線粒體上的電子傳遞鏈蛋白復(fù)合體II，通過抑制琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性，影響病原菌呼吸鏈上的電子傳遞，抑制呼吸，阻斷能量代謝，從而抑制病原菌生長[8-9]。目前，該類藥劑在多種病原菌的防治上發(fā)揮著重要的作用[10]。由巴斯夫公司開發(fā)的新型煙酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑啶酰菌胺，被廣泛應(yīng)用于水果及蔬菜上的灰霉病。WANG等[11]研究發(fā)現(xiàn)，啶酰菌胺對油菜菌核病也具有較高的防治效果，該藥劑250 g a.i./hm2處理對油菜菌核病的田間防治效果為75.10%。此外，由先正達(dá)公司開發(fā)的新型SDHI類殺菌劑吡唑萘菌胺對子囊菌類（Ascomycetes）及擔(dān)子菌類（Basidipmycetes）均具有很高的抑制活性[12]。但該類藥劑在中國僅有啶酰菌胺登記在油菜菌核病防治上，尚未見防治蔬菜菌核病的登記及應(yīng)用?！颈狙芯壳腥朦c】氟吡菌酰胺（fluopyram）是由德國拜耳公司開發(fā)的一種吡啶-乙基-苯甲酰胺類琥珀酸脫氫酶抑制劑[13]，在中國已被登記用于防治番茄根結(jié)線蟲、黃瓜灰霉病和白粉病[14]；近年來，在蔬菜上的應(yīng)用范圍在不斷擴大，其防治蔬菜菌核病的作用值得明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測定不同發(fā)育階段的菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性，并通過田間藥效試驗評價其對菌核病的防治效果，以期全面了解該藥劑防治菌核病的潛力，為其進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 2016—2017年，采自山東省昌樂、壽光、青州、臨朐和泰安等地的黃瓜、番茄、茄子、西葫蘆、蕓豆、辣椒等作物，共獲得173個核盤菌株。

1.1.2 供試藥劑 96%氟吡菌酰胺原藥和 41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑（拜耳作物科學(xué)有限公司），40%菌核凈可濕性粉劑（江西禾益化工股份有限公司），50%多菌靈可濕性粉劑（浙江新安化工集團股份有限公司）。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性測定 采用菌絲生長速率法[15]。將 96%的氟吡菌酰胺原藥用甲醇溶解，配成 1.0×104μg·mL-1的母液，再用含有0.1%吐溫-80的無菌水稀釋成系列濃度的氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后與加熱冷卻至 45℃左右的 PDA培養(yǎng)基混合，制成濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 μg·mL-1的含藥平板。將供試菌株在PDA平板上純化培養(yǎng)3 d后，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，然后將菌餅的菌絲面朝下接種在平板中央。每處理設(shè) 4次重復(fù)，并設(shè)不含藥劑的空白溶劑對照。于25℃培養(yǎng)2 d后，用十字交叉法測定菌落直徑并計算氟吡菌酰胺對菌核病菌菌絲生長的抑制中濃度（EC50）。

1.2.2 氟吡菌酰胺對菌核病菌菌核產(chǎn)量的影響 隨機選取來自不同作物的菌核病菌菌株（QZ5、CL22、LQ3）用于測定。從培養(yǎng)3 d的菌落邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，并接種到含 0.4、0.8、1.6 μg·mL-1氟吡菌酰胺的PDA平板上。每處理設(shè)4次重復(fù)，并設(shè)不含藥

劑的空白溶劑對照。試驗進行3次。于25℃培養(yǎng)30 d后，測定每皿的菌核數(shù)量和菌核干重[16]。

1.2.3 氟吡菌酰胺對菌核菌絲型萌發(fā)的抑制活性隨機選取來自不同作物的菌核病菌菌株（QZ5、CL22、LQ3），在PDA平板上培養(yǎng)15 d后，收集直徑為3—5 mm的菌核，然后經(jīng)0.5% NaClO消毒3 min后，用無菌蒸餾水沖洗3次，然后在室溫下用濾紙擦干。將處理后的菌核嵌入到含 0.5、1、2、5 μg·mL-1氟吡菌酰胺的PDA平板上，每皿接5個菌核，每30個菌核設(shè)為一個重復(fù)，每處理設(shè)4次重復(fù)，并設(shè)不含藥劑的空白溶劑對照，試驗進行3次。于25℃培養(yǎng)3、4、5 d后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌核萌發(fā)出的菌絲。若菌絲長度超過2 mm則視為萌發(fā)，連續(xù)3 d記錄萌發(fā)的菌核數(shù)，計算氟吡菌酰胺對菌核菌絲型萌發(fā)的抑制率[17]。菌核萌發(fā)抑制率（%）=（對照菌核萌發(fā)數(shù)-處理菌核萌發(fā)數(shù)）/對照菌核萌發(fā)數(shù)×100。

1.2.4 氟吡菌酰胺對菌核病的保護與治療作用 保護與治療作用的測定參照KUANG等[18]的方法，略作改進。選取大小一致、葉齡一致的茄子葉片（品種黑旋風(fēng)），經(jīng)0.5% NaClO消毒1 min后，用無菌蒸餾水沖洗3次，自然晾干后放置于鋪有濕潤濾紙的直徑9 cm的培養(yǎng)皿中。用無菌水將41.5%的氟吡菌酰胺懸浮劑稀釋成 5、10、20、40 μg·mL-1系列濃度的藥液，對照藥劑40%菌核凈可濕性粉劑和50%多菌靈可濕性粉劑均配成濃度為40 μg·mL-1的藥液，無菌水為空白對照，每處理設(shè)6個重復(fù)。試驗進行3次。隨機選取一個菌核病菌菌株（QZ22）用于接種試驗。保護作用于施藥24 h后接菌，治療作用于施藥前24 h接菌，處理葉片放置于培養(yǎng)箱（25℃，光周期12 h/12 h；相對濕度80%）中培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量病斑直徑，計算氟吡菌酰胺對菌核病的防治效果。菌落增長直徑（mm）=菌落直徑-菌餅直徑；相對防治效果（%）=（對照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑）/對照菌落增長直徑×100。

1.2.5 氟吡菌酰胺防治茄子菌核病田間藥效試驗參照《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則》進行[19]。分別于2016年11月和2017年11月在山東省昌樂市三河村的拱棚中進行；供試茄子品種均為黑旋風(fēng)。共設(shè)置6個處理，有效成分濃度依次為：（1）氟吡菌酰胺 100 g·hm-2；（2）氟吡菌酰胺 150 g·hm-2；（3）氟吡菌酰胺 200 g·hm-2；（4）菌核凈 600 g·hm-2；（5）多菌靈 1 125 g·hm-2；（6）清水對照，噴液量為750 L·hm-2。每小區(qū)面積為32 m2，采用隨機區(qū)組排列，每處理設(shè)4個重復(fù)。于零星發(fā)病初期進行施藥，每隔7 d施藥1次，共噴施2次，于末次施藥后14 d調(diào)查植株的病情指數(shù)，計算防治效果。病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)參照油菜菌核病分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑；1級，發(fā)病面積占主莖表面積的5%以下；3級，發(fā)病面積占主莖表面積的6%—15%；5級，發(fā)病面積占主莖表面積的 16%—30%；7級，發(fā)病面積占主莖表面積的 31%—50%；9級，發(fā)病面積占主莖表面積的50%以上。病情指數(shù)= Σ[（病級數(shù)×各病級株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×9）]×100；防治效果（%）=（對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對照組病情指數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.05軟件計算氟吡菌酰胺的EC50，采用最小顯著差異法（LSD法）進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 山東地區(qū)蔬菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性

來自 6種作物上的菌核病菌對氟吡菌酰胺均敏感，且其平均 EC50無顯著差異（表 1），表明這 173株菌核病菌可以被用來分析蔬菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性水平。氟吡菌酰胺對 173個菌核病菌的EC50值分布范圍為 0.02—0.30 μg·mL-1，均值為（0.11±0.01）μg·mL-1，變異系數(shù)為 17，EC50頻率分布呈單峰偏正態(tài)曲線分布（圖1），表明該地區(qū)的蔬菜菌核病菌對氟吡菌酰胺的敏感性未出現(xiàn)明顯分化，未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的亞群體。

2.2 氟吡菌酰胺對菌核病菌菌核產(chǎn)量的影響

菌株QZ5、CL22、LQ3的菌核生長的表觀形態(tài)各不相同（圖2-A），但隨著氟吡菌酰胺濃度的增加，同一菌株的菌核數(shù)量和干重均表現(xiàn)出相同的下降趨勢（圖2-C、2-D）。氟吡菌酰胺處理濃度為1.6 μg·mL-1時，3個菌株的菌核產(chǎn)量均明顯少于其他處理組的對應(yīng)菌株。且與對照組的菌核相比，藥劑處理后菌株QZ5、CL22、LQ3的菌核體積變小（圖2-B），表明該藥劑能夠影響菌核的活力[20]。

2.3 氟吡菌酰胺對菌核菌絲型萌發(fā)的影響

隨著濃度的提高，氟吡菌酰胺對菌核菌絲型萌發(fā)的抑制作用逐漸增強。在黑暗條件下培養(yǎng)3、4、5 d時，5 μg·mL-1氟吡菌酰胺對菌核萌發(fā)的抑制率分別為100.00%、98.33%、96.67%（菌株 QZ5），100.00%、97.50%、95.83%（菌株CL22）和100.00%、100.00%、95.83%（菌株LQ3），顯著高于其他處理組（表2）。隨著時間的延長，氟吡菌酰胺對菌核萌發(fā)的抑制率逐漸降低，表明不同菌株菌核的敏感性存在一定差異。

2.4 氟吡菌酰胺對菌核病的保護與治療作用

隨著濃度提高，氟吡菌酰胺對菌核病的保護作用與治療作用逐漸增強。當(dāng)處理濃度達(dá)到40 μg·mL-1，氟吡菌酰胺對菌核病的保護作用防治效果達(dá)到100%，能夠完全抑制病斑擴展，而其治療作用防治效果為88.81%，低于其保護作用防治效果，但是顯著高于對照藥劑多菌靈和菌核凈的防治效果（表3）。由此可見，氟吡菌酰胺同時具有保護與治療防治效果，且保護作用優(yōu)于治療作用。

圖2 氟吡菌酰胺對菌核病菌菌核產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of fluopyram on sclerotial prudction of S. sclerotiorum

表2 氟吡菌酰胺對菌核菌絲型萌發(fā)的抑制作用Table 2 Effect of fluopyram on myceliogenic germination of sclerotia of S. sclerotiorum

2.5 氟吡菌酰胺對茄子菌核病的田間防治效果

5種藥劑處理對茄子菌核病均有一定的防治效果。當(dāng)氟吡菌酰胺的施用劑量為200 g a.i./hm2時對茄子菌核病的防治效果分別為90.30%（2016年）和87.60%（2017年），顯著高于氟吡菌酰胺其他施用劑量以及對照藥劑菌核凈600 g a.i./hm2、多菌靈1 150 g a.i./hm2的防治效果（表4）。

表3 氟吡菌酰胺對菌核病的保護與治療作用Table 3 Protective and curative effects of fluopyram on S. sclerotiorum on leaves of eggplants

表4 氟吡菌酰胺對茄子菌核病的田間防治效果Table 4 Control efficacy of fluopyram on Sclerotinia stem rot of eggplant in the field

3 討論

近年來，隨著設(shè)施蔬菜的種植面積不斷擴大以及復(fù)種指數(shù)的提高，菌核病危害日趨嚴(yán)重。菌核病難防的主要原因首先是菌核作為病害循環(huán)的初侵染源以及病原菌存活的主要形式，可以在不良環(huán)境中存活8年之久[21-22]；其次菌核可以萌發(fā)形成子囊盤，釋放子囊孢子，并隨氣流傳播數(shù)千米，隨后生成菌絲侵染寄主的莖、葉、果實，這是菌核病大范圍發(fā)生的主要原因[23]；最后菌核還可萌發(fā)生成菌絲直接侵染作物根部，導(dǎo)致根腐或莖腐，嚴(yán)重時造成寄主整株死亡[24-25]。因此好的防治藥劑應(yīng)該對菌核各個發(fā)育階段均能夠有效控制。本研究中，氟吡菌酰胺對菌核病菌的菌絲生長、菌核產(chǎn)量以及菌核的菌絲型萌發(fā)均具有較好的抑制效果，因此，其有可能保護寄主免受菌絲侵染，減少再侵染的菌核數(shù)量，切斷其侵染循環(huán)。XU等[17,26]研究發(fā)現(xiàn)，新型 QoI類殺菌劑苯噻菌酯在 5 μg·mL-1的劑量下對菌核菌絲型萌發(fā)的抑制率在80%以上，而且經(jīng)藥劑處理后，菌核數(shù)量減少，但體積變大。然而本研究發(fā)現(xiàn)，氟吡菌酰胺在5 μg·mL-1的劑量下對菌核菌絲型萌發(fā)的抑制率在95%以上，而且在1.6 μg·mL-1的劑量下，菌核的數(shù)量和干重明顯減少，且體積變小，嚴(yán)重影響菌核的活力。根據(jù)氟吡菌酰胺對不同發(fā)育階段菌核病菌所表現(xiàn)出的良好生物活性可以推斷該藥劑對于菌核病防治具有較大的應(yīng)用潛力。

由于氟吡菌酰胺屬于單作用位點殺菌劑，潛在抗性風(fēng)險相對較高[27]。因此，在其上市之前，了解菌核病菌對該藥劑的敏感性對今后制定科學(xué)的使用策略及進行相關(guān)的抗性管理具有重要作用[28]。本研究表明，采自不同地區(qū)和不同作物上的173株核盤菌對氟吡菌酰胺均敏感，且變異系數(shù)較小，說明山東地區(qū)蔬菜菌核病菌對氟吡菌酰胺目前還處在敏感水平，未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的群體。然而蔬菜菌核病菌對該藥劑的EC50頻率分布呈單峰偏正態(tài)曲線分布，這與已報道的油菜菌核病菌對氟硅唑[29]、氟環(huán)唑[30]、氟啶胺[31]、吡唑醚菌酯[15]、肟菌酯[32]等藥劑的 EC50頻率分布圖結(jié)果相似，但同樣不能說明菌株的敏感性水平存在向抗性轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[33]。

氟吡菌酰胺防治菌核病的保護作用優(yōu)于其治療作用，這與多數(shù)殺菌劑作用方式一致。所以，為保證氟吡菌酰胺田間防病效果，在田間應(yīng)盡量在發(fā)病前或發(fā)病初期使用。兩年的田間試驗中，200 g a.i./hm2氟吡菌酰胺在田間有零星病株時施用的防治效果均高達(dá)85%以上，顯著高于對照藥劑菌核凈以及多菌靈。而在室內(nèi)離體葉片接種試驗中，菌核凈和多菌靈對菌核病的防治效果與氟吡菌酰胺的防治效果差距不太大。這種現(xiàn)象可能與田間菌核病在葉片和莖稈均有發(fā)生，二者對藥劑的附著和吸收傳導(dǎo)程度不同，以及藥劑在環(huán)境中的穩(wěn)定性存在差別有關(guān)。此外，考慮到 SDHI類殺菌劑被FRAC列為具有中度或高度抗性風(fēng)險的殺菌劑[34]，所以在實際應(yīng)用時建議氟吡菌酰胺與其他殺菌劑復(fù)配使用，并控制單一生長季節(jié)的使用次數(shù)，以延緩抗藥性的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

新型琥珀酸脫氫酶抑制劑氟吡菌酰胺對菌核病菌的菌絲生長、菌核形成及萌發(fā)均具有較高的抑制活性，在田間能夠有效地控制菌核病發(fā)生，因此該藥劑防治菌核病具有很高的應(yīng)用潛力，可作為防治作物菌核病的候選藥劑。