間歇出酶對(duì)紙漿產(chǎn)纖維素酶的促進(jìn)作用

王 磊，王步成，勇 強(qiáng)，余世袁

(南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037)

能源是人類生存和發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，隨著不可再生能源的逐漸枯竭，開發(fā)可再生資源、尋找替代物成為社會(huì)發(fā)展的必然趨勢(shì)[1]。利用氣化、熱解和生物轉(zhuǎn)化等途徑將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為能源，其中，通過生物轉(zhuǎn)化制取纖維素乙醇是最受關(guān)注的研究之一。纖維素乙醇作為一種可再生的清潔能源，既不與民爭(zhēng)糧，又能避免燃燒秸稈帶來的環(huán)境污染問題，還能增加農(nóng)民的收入，具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。我國(guó)政府要求到2020年在全國(guó)范圍推廣車用乙醇汽油，需要燃料乙醇1 200萬t以上，除適度發(fā)展糧食燃料乙醇外，還需要大力發(fā)展纖維素燃料乙醇等先進(jìn)生物液體燃料，這為纖維素乙醇提供了發(fā)展機(jī)遇。

纖維素乙醇的生產(chǎn)工藝包括原料預(yù)處理、纖維素酶水解、戊糖己糖發(fā)酵等步驟。經(jīng)濟(jì)分析表明，在整個(gè)生產(chǎn)工藝中，纖維素酶水解的成本占總成本的40%以上[3]，高昂的纖維素酶成本是制約木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的一個(gè)瓶頸[4]。所以，使用廉價(jià)的木質(zhì)纖維原料為碳源并提高纖維素酶產(chǎn)率，是降低纖維素酶生產(chǎn)成本、實(shí)現(xiàn)纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。

工業(yè)化酶制備主要有間歇產(chǎn)酶、分批補(bǔ)料產(chǎn)酶和連續(xù)產(chǎn)酶等3種方式。其中，分批補(bǔ)料產(chǎn)酶可以大幅度提高底物濃度，獲得較高的酶活力，因而得到廣泛應(yīng)用。但是，分補(bǔ)料產(chǎn)酶需要較長(zhǎng)的操作時(shí)間才能完成。在長(zhǎng)時(shí)間的產(chǎn)酶過程中，許多物理、化學(xué)及生物學(xué)因素，如攪拌的剪切力、酶蛋白和固體底物的碰撞、氣-液相的接觸、代謝產(chǎn)物的抑制作用等，都可能使細(xì)胞降低產(chǎn)酶能力，或者使酶蛋白失活。因此，改進(jìn)分批補(bǔ)料工藝，提高產(chǎn)酶能力，是纖維素酶研究領(lǐng)域的重要課題。

本研究中，筆者在分批補(bǔ)料制備纖維素酶時(shí)，提出了間歇出酶的方法，即在產(chǎn)酶過程中定期取出部分已產(chǎn)出的酶蛋白，既保護(hù)酶蛋白不受長(zhǎng)時(shí)間操作的損傷，又可降低培養(yǎng)液中的產(chǎn)物濃度，以提高產(chǎn)酶能力。為避免感染雜菌，同時(shí)考察菌絲體不返回培養(yǎng)液對(duì)產(chǎn)酶的影響，以期為工業(yè)化生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

里氏木霉(Trichodermareesei)Rut C30，纖維素酶生產(chǎn)菌株，接種于馬鈴薯-瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)7 d，4 ℃下保存?zhèn)溆茫赡暇┝謽I(yè)大學(xué)生物化工實(shí)驗(yàn)室提供。

針葉材紙漿由南京林業(yè)大學(xué)造紙系提供。物料用粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，10 g紙漿加入100 mL 15 g/L的H2SO4溶液，攪拌均勻后于121 ℃水解1 h，用溫水洗滌直至洗出液呈現(xiàn)中性，4 ℃下保存?zhèn)溆谩０凑誑REL方法[5]對(duì)物料進(jìn)行成分分析，主要成分如下：未經(jīng)過稀酸水解的紙漿中，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.31%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.22%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.95%；經(jīng)過稀酸水解之后，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升至85.37%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.64%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.65%。

稀酸蒸汽爆破的玉米秸稈由南京林業(yè)大學(xué)生物化工實(shí)驗(yàn)室提供。篩選粒度為3～5 cm的玉米秸稈，用0.5%～1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的稀酸浸泡2 h，然后于170 ℃、1.5～2.2 MPa下處理5 min，經(jīng)大量蒸餾水洗滌呈中性后，于4 ℃下保存?zhèn)溆?。按照NREL方法[5]進(jìn)行成分分析，得到酸爆玉米秸稈的纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.90%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.93%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.61%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素生產(chǎn)

活化培養(yǎng)基為Mandels培養(yǎng)基[6]。分批補(bǔ)料產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分：1 g/L 葡萄糖，2 g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4，0.3 g/L CaCl2，1 g/L蛋白胨，3.7 mg/L CoCl2·6H2O，1.4 mg/L ZnSO4·7H2O，1.6 mg/L MnSO4·H2O，5 mg/L FeSO4·7H2O和2 mL/L吐溫80，培養(yǎng)基用檸檬酸-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)初始pH為4.8±0.1。

起始碳源為紙漿，纖維素質(zhì)量濃度為8 g/L，起始氮源為1.83 g/L的(NH4)2SO4和0.13 g/L的尿素；補(bǔ)加的碳源為稀酸水解紙漿(纖維素質(zhì)量濃度為6 g/L)，補(bǔ)加的氮源為1.153 g/L 的(NH4)2SO4和0.262 g/L的尿素。

將里氏木霉試管斜面孢子接入250 mL錐形瓶中，瓶中裝有50 mL活化培養(yǎng)基，在30 ℃、170 r/min的活化條件下培養(yǎng)36 h?；罨蟮木z體按接種量10%(體積分?jǐn)?shù))接入裝有50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶第1天溫度控制在30 ℃，第2天之后控制在28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min。

1)分批補(bǔ)料產(chǎn)酶。起始碳源為紙漿，產(chǎn)酶過程中每隔24 h補(bǔ)加稀酸水解紙漿。

2)間歇出酶。在分批補(bǔ)料的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，從產(chǎn)酶第4天開始，每隔24 h進(jìn)行間歇出酶實(shí)驗(yàn)。模式1：在800 r/min、10 min的條件下將酶液與菌絲體離心分離，然后取出不同體積分?jǐn)?shù)的酶液，剩余的酶液和菌絲體回收，并向培養(yǎng)體系中補(bǔ)加相同體積的填補(bǔ)液，進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)酶直至第8天結(jié)束。模式2：由于取出的酶液和菌絲量是一樣的，直接搖勻取出所需量的發(fā)酵液，然后補(bǔ)加相同體積的填補(bǔ)液繼續(xù)產(chǎn)酶，第8天結(jié)束產(chǎn)酶收取全部酶液。

1.2.2 纖維素酶水解

稱取2.5 g的絕干酸爆玉米秸稈于酶解瓶中，按實(shí)驗(yàn)要求加入纖維素酶20 FPU/g(以1 g纖維素計(jì))、1 mol/L的檸檬酸緩沖液2.5 mL以及適量蒸餾水，使酶水解體系的總體積為50 mL，在pH為4.8、150 r/min、50 ℃條件下酶水解48 h。

酶水解得率=(0.9ρV)/(mw)×100%

(1)

式中：ρ為水解液中還原糖質(zhì)量濃度，g/L；V為水解液體積，L；0.9為纖維素和葡萄糖、纖維二糖之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)；m為原料的絕干質(zhì)量，g；W為原料中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3 分析方法

濾紙酶活力和β-葡萄糖苷酶活力是采用國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(IUPAC)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法[7]測(cè)定。一個(gè)濾紙酶活力的國(guó)際單位(FPU)等于在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘生成1 μmol葡萄糖量所需的酶量。一個(gè)β-葡萄糖苷酶活力國(guó)際單位(U)定義為標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物(即生成2 μmol葡萄糖)的酶量。

蛋白質(zhì)含量通過Bradford法[8]進(jìn)行測(cè)定，Bradford Reagent購于Sigma-Aldrich公司。

由于存在纖維素，菌絲體濃度無法直接測(cè)量，只有通過測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度來計(jì)算得到[9]。培養(yǎng)液離心得到固體渣，將固體渣用蒸餾水定容至50 mL，混合均勻后得到測(cè)定液。取10 mL測(cè)定液，經(jīng)G3玻砂漏斗過濾后，用15 mL、0.2 mol/L的NaOH溶液將固體轉(zhuǎn)移至25 mL刻度試管中，100 ℃沸水中煮20 min，取出后加蒸餾水定容至25 mL，用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定酶水解液中的糖濃度。在色譜儀Agilent 1100型高效液相色譜儀上，采用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色譜柱，以0.005 mol/L的H2SO4作為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，色譜柱溫為55 ℃，采用示差折光檢測(cè)器(RI)檢測(cè)，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批補(bǔ)料產(chǎn)酶

采用間歇方式生產(chǎn)纖維素酶時(shí)，濾紙酶活最高可達(dá)到2.45 FPU/mL，β-葡萄糖苷酶活達(dá)到0.92 U/mL。纖維素在第2天被大量消耗，用以支持菌絲體的生長(zhǎng)以及纖維素酶的合成；第3天后，培養(yǎng)基中的纖維素所剩無幾，此時(shí)沒有足夠的碳源來維持菌絲體的生存和產(chǎn)酶，所以菌絲體開始逐漸死亡，pH逐漸升高。當(dāng)培養(yǎng)基中再無纖維素可利用時(shí)，濾紙酶活開始下降。提高底物濃度可以促進(jìn)菌絲體的生長(zhǎng)，增加纖維素酶的產(chǎn)量。

為了提高纖維素酶的產(chǎn)量和得率，采用分批補(bǔ)料方式確保體系中有足夠的碳源支持菌絲體的生長(zhǎng)以及纖維素酶的合成。以紙漿為底物，起始碳源為紙漿，纖維素質(zhì)量濃度為8 g/L，每隔24 h補(bǔ)加稀酸水解紙漿(纖維素質(zhì)量濃度為6 g/L)，第8天收樣，產(chǎn)酶結(jié)果如圖1所示。

圖1 分批補(bǔ)料產(chǎn)酶時(shí)各參數(shù)的變化情況Fig.1 Changes of parameters during fed-batch cellulase preparation

由圖1可知：每天補(bǔ)加6 g/L纖維素的稀酸水解紙漿，纖維素酶活逐漸增加，至第8天收樣時(shí)，濾紙酶活達(dá)到9.78 FPU/mL，此時(shí)β-葡萄糖苷酶活為1.72 U/mL，與間歇產(chǎn)酶相比，濾紙酶活增加了3倍，β-葡萄糖苷酶活增加了86.96%。胞外蛋白的濃度隨著酶活的增加而穩(wěn)定上升，第8天蛋白質(zhì)量濃度可以達(dá)到3.14 g/L。但隨著纖維素的不斷補(bǔ)加，菌絲體持續(xù)生長(zhǎng)，收樣時(shí)菌絲體質(zhì)量濃度可以達(dá)到8.65 g/L，此時(shí)培養(yǎng)液比較黏稠，傳質(zhì)比較困難。

目前，很多學(xué)者都采用分批補(bǔ)料的方式生產(chǎn)纖維素酶，得到了較高的纖維素酶產(chǎn)率。Ma等[10]以微晶纖維素為碳源， Shibuya等[11]以蒽醌燒堿法紙漿為碳源，采用分批補(bǔ)料的培養(yǎng)方式生產(chǎn)纖維素酶，均得到了10 FPU/mL以上的濾紙酶活。由于濾紙酶活是綜合酶活力的代表，β-葡萄糖苷酶活因含量低而受到普遍關(guān)注，因此本實(shí)驗(yàn)主要測(cè)定這2種酶活。濾紙酶活采用沃特曼(Watman)1號(hào)濾紙為底物，β-葡萄糖苷酶活采用對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，這2種底物質(zhì)量穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性比較好。其他酶活(如，微晶纖維素酶活和羧甲基纖維素酶活)的測(cè)定，由于不同批次的底物質(zhì)量不夠穩(wěn)定，測(cè)定數(shù)據(jù)的重復(fù)性較差，所以本實(shí)驗(yàn)沒有采用。本實(shí)驗(yàn)所用的紙漿是大宗工業(yè)產(chǎn)品，纖維素含量高，且價(jià)格不高，是誘導(dǎo)纖維素酶的較好原料。但是，紙漿纖維素的結(jié)晶度較高，無定形區(qū)較少，影響了里氏木霉菌絲體分泌的纖維素酶對(duì)纖維素的降解作用。經(jīng)過稀酸處理后的紙漿纖維長(zhǎng)度變短、分絲帚化程度提高，有利于纖維素酶的攻擊。實(shí)驗(yàn)證明，這2種紙漿的合理搭配使用，能大幅度提高纖維素酶的產(chǎn)率。

分批補(bǔ)料產(chǎn)酶能夠有效解決碳源不足的問題，提高纖維素酶的產(chǎn)量，但是在纖維素酶生產(chǎn)上仍然存在問題。第一，在分批補(bǔ)料過程中，隨著碳源的逐漸添加，菌絲體不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)酶后期菌絲體生長(zhǎng)過多，導(dǎo)致反應(yīng)液黏稠，體系傳質(zhì)困難。第二，分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶需要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，但在此過程中，力學(xué)、化學(xué)以及熱力學(xué)因素都有可能對(duì)已經(jīng)產(chǎn)出的酶蛋白產(chǎn)生負(fù)面影響，從而影響纖維素酶的生產(chǎn)[12]。因此，出于保護(hù)培養(yǎng)液中酶蛋白的目的，本研究中，筆者提出了間歇出酶的方法，即定期將已產(chǎn)出的酶蛋白從培養(yǎng)液中分離出來，并考察取出的菌絲體不返回培養(yǎng)液的情況對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2.2 間歇出酶

在產(chǎn)酶進(jìn)行一段時(shí)間后取出部分酶液，離心分離后，菌絲體返回錐形瓶中繼續(xù)產(chǎn)酶，同時(shí)補(bǔ)加等量的填補(bǔ)液以保持培養(yǎng)液體系不變[13]。為減少在產(chǎn)酶過程中各種負(fù)面因素對(duì)纖維素酶活的影響，實(shí)驗(yàn)中采用不同的間歇出酶方式。在分批補(bǔ)料的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，從產(chǎn)酶第4天開始出酶，分為3種方式：①每天出酶，每次出酶15.0%即7.5 mL(1—15.0%)；②每隔2天出酶，每次出酶30%即15 mL(2—30.0%)；③每隔3天出酶，每次出酶45.0%即22.5 mL(3—45.0%)。第8天結(jié)束產(chǎn)酶、收樣，產(chǎn)酶結(jié)果見表1。本文表中測(cè)得的酶活是當(dāng)天出酶前的數(shù)據(jù)，總酶活則包括前期出酶所收獲的總量。

表1 間歇出酶方式對(duì)纖維素酶生產(chǎn)的影響

由表1可知：當(dāng)每天回收15.0%的酶液時(shí)，總濾紙酶活達(dá)到693.48 FPU，和分批補(bǔ)料對(duì)照實(shí)驗(yàn)的489.00 FPU相比，提高了41.82%，總酶活提高率較明顯；當(dāng)每2天出酶30.0%時(shí)，總濾紙酶活提高率只有2.85%；而當(dāng)每3天出酶45.0%時(shí)，總濾紙酶活與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比下降了12.00%。結(jié)果表明，出酶量的大小對(duì)纖維素酶的生產(chǎn)影響較大。

里氏木霉被認(rèn)為是不善于生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的。一般情況下，里氏木霉生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶和纖維素酶的比例在0.3～0.5，而纖維素降解成葡萄糖所需的最佳比例是1∶ 1[14]。分批補(bǔ)料生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶總酶活為86.00 U，而間歇出酶總酶活最高可達(dá)到134.08 U，相比提高了55.91%。定期酶回收可以有效保護(hù)已生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶，這可能就是回收酶后總酶活提高的原因。

2.3 間歇出酶量的優(yōu)化

出酶量的大小對(duì)于纖維素酶的產(chǎn)量有較大的影響，為研究不同的出酶量對(duì)纖維素酶生產(chǎn)的影響，在分批補(bǔ)料的基礎(chǔ)上，從產(chǎn)酶第4天開始，每天將培養(yǎng)液離心后取出部分酶液，取出量分別為10.0%、12.5%、15.0%、17.5%和20.0%，剩余組分全部轉(zhuǎn)入錐形瓶中，補(bǔ)加等量的填補(bǔ)液以保持培養(yǎng)液體積不變，之后繼續(xù)產(chǎn)酶。第8天結(jié)束產(chǎn)酶、收樣。不同出酶量對(duì)纖維素酶生產(chǎn)的影響如表2所示。

表2 間歇出酶過程中每天不同出酶量對(duì)纖維素酶生產(chǎn)的影響

由表2可以看出：濾紙酶活在第8天可以達(dá)到最大，出酶量為10.0%時(shí)濾紙酶活為9.74 FPU/mL，當(dāng)出酶量逐漸增加時(shí)最大酶活逐漸減小，這可能是因?yàn)槿〕龃罅康拿钢笈囵B(yǎng)體系受到影響。當(dāng)每天回收10.0%～20.0%的酶液時(shí)，與分批補(bǔ)料相比，總的濾紙酶活提高了26.30%～40.31%。其中，每天回收15%的酶液時(shí)，總濾紙酶活提高率最大，可以達(dá)到40.31%。

分批補(bǔ)料時(shí)β-葡萄糖苷酶總酶活為86.00 U，而采用間歇出酶方式生產(chǎn)的總β-葡萄糖苷酶酶活均達(dá)到了146.00 U以上，提高了69%以上。當(dāng)每天回收酶液為12.5%時(shí)，β-葡萄糖苷酶總酶活提高率最大，達(dá)到了108.94%。饒慶隆等[15]以亞硫酸鹽紙漿為碳源，采用分批補(bǔ)料方式生產(chǎn)纖維素酶，得到的β-葡萄糖苷酶活最高為0.27 U/mL。趙士明等[16]用綠液處理得到的玉米秸稈為碳源生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，其最高酶活為1.31 U/mL。由表2可以得出結(jié)論，間歇出酶有利于β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)。

在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)中酶容易失活，定期酶回收可以保護(hù)已生產(chǎn)的酶，尤其是分子量較大的β-葡萄糖苷酶，從而提高纖維素酶的生產(chǎn)效率，改善酶系結(jié)構(gòu)。

2.4 不回收菌絲體時(shí)的間歇出酶量比較

在以上實(shí)驗(yàn)中，間歇出酶時(shí)取出部分酶液后，將離心得到的菌絲體返回培養(yǎng)液繼續(xù)產(chǎn)酶，此過程易使培養(yǎng)液染菌。在出酶時(shí)不返回菌絲體，可以避免雜菌的感染以及離心力對(duì)菌株造成的影響，但對(duì)菌絲體濃度可能有影響。本實(shí)驗(yàn)在間歇出酶的基礎(chǔ)上，每次出酶出菌時(shí)菌絲體不返回培養(yǎng)液，之后補(bǔ)加相同體積的填補(bǔ)液，培養(yǎng)至第8天結(jié)束，研究不同出酶出菌量對(duì)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果見表3。

由表3可知：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的分批補(bǔ)料產(chǎn)酶的總濾紙酶活為489.00 FPU，總β-葡萄糖苷酶活為86.00 U。當(dāng)每天同時(shí)出酶出菌絲15.0%時(shí)，總濾紙酶活達(dá)到698.98 FPU，比對(duì)照提高了42.94%，提高率最大；總β-葡萄糖苷酶活達(dá)到158.53 U，比對(duì)照提高了84.33%。改變每天的出酶出菌絲量，濾紙酶活提高率在37%～43%，而β-葡萄糖苷酶活提高率在66%～100%，這表明不同的出菌絲量對(duì)濾紙酶活的影響較小，但會(huì)控制β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)。當(dāng)每天取出10.0%的酶液和菌絲體時(shí)，總β-葡萄糖苷酶活最高，可達(dá)到171.85 U，酶活提高率為99.83%。隨著取出量的增加，β-葡萄糖苷酶總酶活下降，這可能是因?yàn)槌雒赋鼍吭黾?，取出的酶液和菌絲體會(huì)相應(yīng)變多，對(duì)培養(yǎng)體系造成的影響較大，導(dǎo)致酶活逐漸下降。

表3 間歇出酶出菌量對(duì)產(chǎn)酶的影響

注：纖維素酶得率為1 g 纖維素產(chǎn)FPU的酶活。

綜合分析表2和3的數(shù)據(jù)可以看出：取出少量的菌絲體并不會(huì)對(duì)纖維素酶的生產(chǎn)造成大的影響，濾紙酶活的提高率基本維持在37%～43%，而且將菌絲體與酶液一起取出可以避免離心這一步驟，不僅方便生產(chǎn)，更可以減少感染雜菌的風(fēng)險(xiǎn)。Mandels等[17]認(rèn)為在生產(chǎn)纖維素酶的過程中，纖維素酶的基礎(chǔ)表達(dá)可以將不溶性的纖維類碳源降解成可溶性的，從而大量誘導(dǎo)纖維素酶的生產(chǎn)，因此，無論是僅取出酶液還是菌絲體與酶液一起取出，出酶所得到的纖維素酶產(chǎn)率均高于不出酶時(shí)，纖維素酶的產(chǎn)量可以得到有效的提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，間歇出酶可以有效保護(hù)已經(jīng)產(chǎn)出的酶蛋白，特別是分子量較大的β-葡萄糖苷酶，從而提高纖維素酶的產(chǎn)率。只要菌絲體濃度維持在合理的水平，菌絲體也可以不回收，以防止染菌。

2.5 典型反應(yīng)歷程

以未經(jīng)稀酸水解的針葉材紙漿為初始碳源誘導(dǎo)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶，產(chǎn)酶期間補(bǔ)加稀酸水解的紙漿，補(bǔ)加的纖維素質(zhì)量濃度為6 g/L。從產(chǎn)酶第4天開始，每天出酶出菌絲量為15.0%，第8天收樣，此過程中各參數(shù)隨時(shí)間的變化如圖2所示。

圖2 出酶出菌量為15.0%時(shí)的反應(yīng)歷程Fig.2 Reaction process when 15.0% of enzyme and mycelia were removed daily

由圖2可知：濾紙酶活隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，第8天時(shí)達(dá)到最大值9.70 FPU/mL，此時(shí)β-葡萄糖苷酶活為2.11 U/mL。纖維素酶為胞外酶，胞外蛋白質(zhì)的濃度隨著濾紙酶活和β-葡萄糖苷酶活的增加而穩(wěn)定增加，最高時(shí)可達(dá)到2.72 g/L，但當(dāng)酶活下降時(shí)，蛋白質(zhì)濃度也會(huì)有所下降。雖然每天都補(bǔ)加6 g/L的纖維素，但是其仍在快速消耗，第7天培養(yǎng)基中的纖維素幾乎被完全利用。

在里氏木霉誘導(dǎo)纖維素酶合成的過程中，培養(yǎng)體系的pH是影響菌絲體生長(zhǎng)和纖維素酶生產(chǎn)的重要因素之一[18]。培養(yǎng)基的初始pH是4.8，在產(chǎn)酶初期氮源被利用，而且纖維結(jié)構(gòu)打開后產(chǎn)生一些酸性物質(zhì)，這些都會(huì)導(dǎo)致pH下降[16]。第4～6天，培養(yǎng)基的pH基本維持在里氏木霉的最適pH左右，此時(shí)菌絲體強(qiáng)壯，生產(chǎn)穩(wěn)定，所以纖維素酶活能快速增加。第6天之后，pH隨著纖維素酶的大量合成而迅速上升，這是因?yàn)榫w開始自溶，胞內(nèi)的堿性物質(zhì)以及蛋白分泌出來，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH超出緩沖液的緩沖范圍[13]。

由圖2可知：菌絲體的起始質(zhì)量濃度為0.87 g/L，經(jīng)過初始培養(yǎng)階段的快速生長(zhǎng)后，在第4天菌絲體質(zhì)量濃度達(dá)到4.74 g/L。從第4天開始，每天定時(shí)移出15.0%的培養(yǎng)液，并且其中的菌絲體不返回。在之后幾天中，菌絲體質(zhì)量濃度一直維持在4～5 g/L，產(chǎn)酶能夠順利進(jìn)行。分批補(bǔ)料產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的菌絲體濃度較高，但纖維素酶生產(chǎn)能力并不是很高。本實(shí)驗(yàn)中菌絲體質(zhì)量濃度維持在4～5 g/L，纖維素酶仍能正常生產(chǎn)，并不影響產(chǎn)酶能力，說明高的細(xì)胞濃度在纖維素酶生產(chǎn)中并不是必須的。產(chǎn)酶的主體是菌絲體，合理控制碳源和O2的供給以及酶的存留量，使得碳源酶水解得到的葡萄糖能滿足菌絲體正常的新陳代謝，這是一個(gè)合理產(chǎn)酶體系的關(guān)鍵。因此，本實(shí)驗(yàn)提出的間歇出酶出菌方法，不但保護(hù)了酶蛋白，而且有效控制了菌絲體濃度，從而提高了纖維素酶的產(chǎn)率。

2.6 酶水解

為了評(píng)估各種纖維素酶的水解能力，對(duì)不同的纖維素酶酶解酸爆玉米秸稈的性能進(jìn)行了研究。酶解48 h后，取樣1 mL，10 000 r/min離心5 min，取上清液適當(dāng)稀釋后測(cè)其中的還原糖濃度，由此計(jì)算酶水解得率，結(jié)果見表4。

表4 不同纖維素酶酶解48 h后酶解得率比較

表4中商品酶Novozymes CTec2是一種復(fù)合酶，酶系結(jié)構(gòu)比較合理，通常用于纖維素酶水解實(shí)驗(yàn)，但價(jià)格也較昂貴。由表4可知：本實(shí)驗(yàn)以紙漿為碳源分批補(bǔ)料生產(chǎn)的纖維素酶酶水解得率為91.22%，接近商品酶的水平。間歇出酶和間歇出酶出菌絲的實(shí)驗(yàn)大幅度提高了纖維素酶的產(chǎn)率，其酶水解得率也高達(dá)90.97%和88.89%。研究表明，3種自產(chǎn)纖維素酶的水解能力幾乎相同，這說明在分批補(bǔ)料生產(chǎn)中采用間歇出酶和出菌絲的方式并不會(huì)影響酶的水解能力。宋娜娜等[19]對(duì)里氏木霉和黑曲霉混菌所產(chǎn)的纖維素酶進(jìn)行酶水解實(shí)驗(yàn)，底物質(zhì)量濃度為100 g/L，其余條件與本研究相同，最終得到的酶水解得率為70.00%，其水解性能不如本研究所產(chǎn)的纖維素酶性能好。纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的糖是通過其不同組分酶之間的協(xié)同作用完成的，它受產(chǎn)物纖維二糖的抑制作用，而這種抑制作用可以通過添加β-葡萄糖苷酶來緩解，Tang等[20]通過實(shí)驗(yàn)證明高β-葡萄糖苷酶活性的纖維素酶水解效率比里氏木霉所產(chǎn)纖維素酶的高。本試驗(yàn)所用的商品酶中添加了大量的β-葡萄糖苷酶，其β-葡萄糖苷酶活與纖維素酶活之比遠(yuǎn)高于自產(chǎn)酶，這可能就是自產(chǎn)酶的酶水解效率比商品酶略低的原因。

3 結(jié)論

在以里氏木霉(Trichodermareesei)RUT C30為產(chǎn)酶菌株，以針葉材漂白硫酸鹽紙漿為碳源，分批補(bǔ)料制備纖維素酶的過程中，采用間歇出酶的方法，定期將部分酶蛋白從培養(yǎng)液中分離出來。從第4天開始間歇出酶，當(dāng)每天取出10.0%～20.0%的酶液時(shí)，總濾紙酶活和總β-葡萄糖苷酶活分別提高了26.3%～40.3%和69.8%～108.9%。為避免感染雜菌，菌絲體也可以不回收。當(dāng)每天取出15.0%的酶液與等量的菌絲體時(shí)，與分批補(bǔ)料對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比較，總濾紙酶活提高42.9%，總β-葡萄糖苷酶活提高84.3%，菌絲體質(zhì)量濃度維持在4～5 g/L，結(jié)果表明，只要菌絲體濃度維持在合理范圍內(nèi)，里氏木霉的產(chǎn)酶能力不受影響。

對(duì)自產(chǎn)的纖維素酶進(jìn)行酶水解性能的研究，結(jié)果表明間歇出酶和出菌絲不會(huì)對(duì)纖維素酶的水解能力產(chǎn)生影響，自產(chǎn)酶對(duì)酸爆玉米秸稈的酶水解能力相當(dāng)，酶水解效率均達(dá)到90%左右。

本文提出的間歇出酶方法，既保護(hù)了酶蛋白不受長(zhǎng)時(shí)間操作的損傷，又降低了培養(yǎng)液中的產(chǎn)物濃度，從而顯著提高產(chǎn)酶能力。間歇出酶出菌方法在工業(yè)生產(chǎn)上可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化成連續(xù)抽提分離，即用泵將部分培養(yǎng)液連續(xù)抽出，用離心或超濾裝置予以分離。本技術(shù)操作簡(jiǎn)單，新增成本低，感染雜菌機(jī)會(huì)少，有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。