代謝組學(xué)分析提高谷氨酸棒桿菌L-瓜氨酸產(chǎn)量

許 娟，許 琳，郝 寧

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

代謝組學(xué)(metabolomics)是以機(jī)體內(nèi)所有代謝物為研究對象，利用高通量分析方法，研究生物體系對內(nèi)外擾動(dòng)響應(yīng)情況的學(xué)科[1]，致力于全面分析代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控及其關(guān)聯(lián)性[2-3]。代謝組學(xué)是組學(xué)研究的終點(diǎn)，它以細(xì)胞內(nèi)所有分子量小于1 000的代謝物為對象，進(jìn)行系統(tǒng)的定性、定量分析，以其代謝物的變化繼而挖掘生物體系的代謝表型改變，最接近于生物表型。目前代謝組學(xué)研究廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域。

L-瓜氨酸首次在西瓜中分離得到[4]，是人體尿素循環(huán)的重要參與物質(zhì)。L-瓜氨酸可以提高免疫系統(tǒng)功能、舒張血管、維持正常的膽固醇和血糖水平、治療關(guān)節(jié)炎癥[5-9]。因此在食品、醫(yī)藥等行業(yè)，L-瓜氨酸應(yīng)用越來越廣泛[10]。

谷氨酸棒桿菌是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)行業(yè)最常用的工業(yè)菌種。本研究利用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析手段的代謝組學(xué)方法，以實(shí)驗(yàn)室保藏的谷氨酸棒桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 13032和改造后的L-瓜氨酸高產(chǎn)菌CorynebacteriumglutamicumATCC 13032ΔargGΔargR-pXMJ19-argB(ec) (CIT4)為研究對象，分析確定影響瓜氨酸合成的關(guān)鍵代謝物質(zhì)與代謝途徑，確定瓜氨酸合成的限定條件，通過挖掘胞內(nèi)L-瓜氨酸合成的不足性，提出優(yōu)化添加前體物質(zhì)的方案，以期理性有效地提高谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-瓜氨酸的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌株

C.glutamicumATCC 13032、C.glutamicumATCC 13032ΔargGΔargR- pXMJ19-argB(ec) (CIT4)，南京工業(yè)大學(xué)微生物保藏室保存。

1.2 試劑和儀器

吡啶、N-甲基-N-(三甲基硅氧烷基) 三氟乙酰胺(MSTFA)等衍生化試劑，Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙腈等(AR)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

Trace GC 2000 DSQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國Agilent 公司；QYN100-2型氮?dú)鉂饪s儀，上海喬躍電子有限公司；D5321型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Ultimate 3000型高效液相色譜儀，DioNex中國有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10、瓊脂 20。

發(fā)酵培養(yǎng)基M1(1 L)：葡萄糖80 g、KH2PO41.0 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.02 g、ZnCl21 mg、VB1200 μg；pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基M2(1 L)：葡萄糖80 g、KH2PO41.0 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.02 g、ZnCl21 mg、VB1 200 μg；pH 7.0。

在發(fā)酵過程中，于12 h補(bǔ)加終質(zhì)量濃度為1.0 g/L的谷氨酸和鳥氨酸，24 h補(bǔ)加終質(zhì)量濃度分別為1.5、1.5和2.0 g/L的α-酮戊二酸、氨甲酰磷酸以及谷氨酰胺，36 h補(bǔ)加終質(zhì)量濃度為1.0 g/L的丙酮酸。

1.4 胞內(nèi)代謝物的提取

1)取樣點(diǎn)取發(fā)酵液10 mL，迅速加入20 mL-80 ℃預(yù)冷的60%(體積分?jǐn)?shù))甲醇- 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液，離心收集菌體，并用10 mL 0.9%NaCl洗菌2次，凍于液氮中。

2)加入0.5 mL -20 ℃預(yù)冷的70%甲醇，渦旋混勻，液氮反復(fù)凍融3次后8 000 r/min 冷凍離心5 min，取上清于新管中。

3)再加入0.5 mL-20 ℃預(yù)冷的甲醇-乙腈-水溶液(體積比為2∶ 2∶ 1)，渦旋混勻后，8 000 r/min 冷凍離心5 min，吸取上清與之前的清液混合。

1.5 樣品衍生化

取150 μL提取液并加入30 μL內(nèi)標(biāo)混合液(0.2 mg/mL核糖醇)，混勻后N2吹干；在干燥的樣品中加入40 μL甲氧胺鹽酸鹽的吡啶溶液(120 mg/mL)，40 ℃水浴反應(yīng)30 min；再加入80 μLN-甲基-N-(三甲基硅氧烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)，30 ℃水浴反應(yīng)90 min。

1.6 代謝物的檢測

GC-MS檢測條件參照文獻(xiàn)[11]。

1.7 代謝物數(shù)據(jù)的分析

將GC-MS所得的質(zhì)譜峰導(dǎo)入到AMDIS軟件，并與NIST數(shù)據(jù)庫比對，對質(zhì)譜峰進(jìn)行定性分析；將質(zhì)譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積對比進(jìn)行定量分析，使得代謝物含量標(biāo)準(zhǔn)化。所有定量化的多維數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Expander(version 6.0)軟件中，進(jìn)行聚類分析得到熱圖。然后將分析結(jié)果帶入SIMCA-P(version 11.0)軟件中，得到主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS)分析圖，并且利用載荷圖、T-test以及變量重要性因子(VIP)找出生物標(biāo)志物[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌與重組菌發(fā)酵過程比較

對L-瓜氨酸生成過程的相關(guān)發(fā)酵參數(shù)監(jiān)測，從而考察菌體中各個(gè)發(fā)酵參數(shù)變化的趨勢，借此系統(tǒng)地考察標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 13032和重組菌CIT4的差異性，結(jié)果見圖1。

圖1 ATCC 13032與CIT4菌株發(fā)酵參數(shù)曲線 Fig.1 Fermentation parameters of C.glutamicum CIT4

由圖1可知：2株菌的生長曲線，將細(xì)胞生長分為延滯期(0～24 h)、對數(shù)生長期(24～36 h)、穩(wěn)定期(36～48 h)和衰退期(48～60 h)。與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13032相比，CIT4菌株生長期有所延長，并且L-瓜氨酸質(zhì)量濃度為18.50 g/L，而標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 13032沒有L-瓜氨酸的生成。

2.2 發(fā)酵過程中胞內(nèi)代謝物的分析

基于GC-MS代謝輪廓分析的方法，進(jìn)一步研究比較兩種菌體的胞內(nèi)物質(zhì)動(dòng)態(tài)代謝差異。在發(fā)酵的4個(gè)階段，分別從C.glutamicumATCC 13032和C.glutamicumCIT4中取樣，共定量檢測出124種化合物，其中86種被鑒定，包括19種氨基酸、28種有機(jī)酸、12種糖類和糖醇及9種脂類、4種醇類、5種胺類及9種其他類型代謝物，結(jié)果見圖2。由圖2可知：在重組菌CIT4中，發(fā)酵至24 h后，胞內(nèi)谷氨酸、4-氨基丁酸、L-賴氨酸、纈氨酸的代謝水平較高，說明此時(shí)CIT4菌株胞內(nèi)氮代謝比ATCC 13032菌株中的旺盛[13]，氮元素作為組成微生物中幾乎所有的生物大分子的必需組分，尤其在氨基酸代謝中起著極為關(guān)鍵性的作用，因而對L-瓜氨酸的合成產(chǎn)生關(guān)鍵影響[14]。

紅色代表代謝物濃度高；綠色代表代謝物濃度低圖2 CIT4與ATCC 13032胞內(nèi)代謝物的熱圖Fig.2 Heat map representation of metabolites in CIT4 and ATCC 13032

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析胞內(nèi)關(guān)鍵物質(zhì)

為了深入比較C.glutamicumATCC 13032與C.glutamicumCIT4的總代謝物輪廓的差異性，將GC-MS檢測到的近百種的代謝物的動(dòng)態(tài)變化使用主成分分析(principal component analysis，PCA)進(jìn)行分析。在無監(jiān)督的PCA分析，通過線性變換以減少多個(gè)變量的維度并在新的多變量空間中表示其樣本分布[15]。圖3為CIT4與ATCC 13032樣品的主成分分析結(jié)果。

圖3(a)為PCA得分圖，分析結(jié)果的得分圖可以直接展示出胞內(nèi)代謝的變化情況。PCA模型的R2(X)值為0.931 6，表明了PCA具有較好(>0.8)的可信度。一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)代謝通量，從而可以直觀區(qū)分各個(gè)體系，并且CIT4與ATCC 13032的兩組數(shù)據(jù)存在著明顯的離散分組的現(xiàn)象，這說明兩株菌在相同培養(yǎng)基中不同的培養(yǎng)階段下胞內(nèi)物質(zhì)存在著顯著的差異。

圖3(b)的PCA載荷圖，通過GC-MS測得的86種胞內(nèi)代謝物在載荷圖各有分布，以各物質(zhì)到原點(diǎn)的距離來判斷其對L-瓜氨酸生成的作用程度，變量離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，反映其在發(fā)酵過程中的變化越大，對目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-瓜氨酸合成的貢獻(xiàn)越大。

圖4為偏最小二乘法(PLS)分析的變量重要因子(VIP)圖，VIP表示所鑒定的代謝物對兩株菌中L-瓜氨酸合成差異的貢獻(xiàn)率，并且VIP值越大則表示其與L-瓜氨酸合成的相關(guān)程度越大，對 L-瓜氨酸的貢獻(xiàn)率也就越大[16]。其中，VIP值大于1的代謝物是影響L-瓜氨酸的積累的關(guān)鍵物質(zhì)。由圖4結(jié)果并結(jié)合PCA載荷圖分析可知，對L-瓜氨酸合成影響最顯著的10種生物標(biāo)志物為葡萄糖、α-酮戊二酸(Akg)、丙酮酸(Pyr)、磷酸、乳酸(Lac)、琥珀酸(Suc)、蘋果酸、富馬酸、賴氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)。

圖3 CIT4與ATCC 13032樣品的主成分分析結(jié)果Fig.3 Principal component analysis of CIT4 and ATCC13032(a)PCA score plot t[1]-t[2] and(b)PCA derived loading plot p[1]-p[2]

圖4 偏最小二乘法( OPLS-DA PLS) 得出的與 L-瓜氨酸含量最相關(guān)的胞內(nèi)代謝物VIP圖(置信區(qū)間：0.95)Fig.4 Variable importance factor(VIP)plot of the orthogonal to partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA PLS)model generated from the most correlated intracellular metabolites with L-Citrulline (confidence interval:0.95)

2.4 關(guān)鍵代謝物和代謝途徑分析

為了進(jìn)一步探究L-瓜氨酸累積的機(jī)制、深入地分析這10種關(guān)鍵的生物標(biāo)志物與關(guān)鍵代謝途徑之間的作用關(guān)系，將獲得的生物標(biāo)志物回歸到L-瓜氨酸合成代謝網(wǎng)絡(luò)中，包括中心碳代謝和氨基酸代謝等合成途徑，探究限制L-瓜氨酸累積的原因，挖掘2株菌代謝物的不足之處，并以此指導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基的條件優(yōu)化，增加L-瓜氨酸的產(chǎn)量。

2.4.1 中心碳代謝

圖5為中心碳代謝胞內(nèi)代謝物相對含量。由圖5可知：發(fā)酵至24 h后，菌株CIT4中L-瓜氨酸開始累積，此時(shí)丙酮酸迅速被利用，其相對含量由24 h的28迅速下降到48 h的7，與此同時(shí)，胞內(nèi)乳酸的相對含量也從35迅速下降到12。而標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 13032中丙酮酸和乳酸都有一定的累積。這說明CIT4中更多的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，代謝流向主要集中于三羧酸循環(huán)(TCA)過程中，而乳酸作為生成L-瓜氨酸的主要副產(chǎn)物，競爭糖酵解途徑(EMP)的碳流量。α-酮戊二酸是TCA循環(huán)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是連接碳-氮代謝的關(guān)鍵代謝中間體[17]。在24 ～48 h階段，L-瓜氨酸大量合成，CIT4中α-酮戊二酸的相對含量由23下降至4，琥珀酸、富馬酸以及蘋果酸的含量也迅速下降。ATCC 13032中這幾種物質(zhì)含量均比CIT4高，并且呈上升趨勢。這表明在CIT4中的α-酮戊二酸更多的用于合成氨基酸代謝的前體物質(zhì)谷氨酸。ATCC 13032中α-酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸的相對含量較高，說明其TCA循環(huán)較為活躍，導(dǎo)制碳源被轉(zhuǎn)化為CO2釋放到細(xì)胞體外，消耗更多的碳資源。在發(fā)酵前期，CIT4 戊糖磷酸途徑(HMP)中核糖-5-磷酸和赤蘚糖-4-磷酸(E4P)相對含量都要比ATCC 13032菌株高，HMP途徑代謝活躍，為L-瓜氨酸合成提供大量的還原力NADPH。而在發(fā)酵后期，隨著瓜氨酸的積累，細(xì)胞停止生長，磷酸戊糖途徑的代謝通量大大降低。此結(jié)果表明，葡萄糖-6-磷酸分支點(diǎn)周圍的磷酸戊糖途徑的通量分布隨著瓜氨酸產(chǎn)量的增加而降低[18]。

G6P—葡萄糖-6-磷酸;3PG—3-磷酸甘油酸;Ppa—磷酸吡哆醛；X5P—木酮糖-5-磷酸圖5 中心碳代謝胞內(nèi)代謝物相對含量Fig.5 Central carbon metabolism intracellular metabolite relative content

2.4.2 氨基酸代謝

圖6為氨基酸代謝胞內(nèi)代謝物相對含量。由圖6可知，CIT4中氨基酸代謝水平整體高于ATCC 13032菌株。谷氨酸作為合成瓜氨酸的前體，其在CIT4菌株中的代謝水平和代謝速率均明顯高于ATCC 13032菌株，說明CIT4胞內(nèi)谷氨酸代謝途徑利用比標(biāo)準(zhǔn)菌更加高效。重組菌CIT4在C.glutamicumATCC 13032的基礎(chǔ)上為解除反饋?zhàn)瓒羟贸薬rgR基因，為了截?cái)喙习彼崂猛緩角贸薬rgG基因。在谷氨酸棒桿菌中N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)作為關(guān)鍵酶受到瓜氨酸的反饋抑制作用，因此構(gòu)建N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)表達(dá)質(zhì)粒，得到菌株C.glutamicumATCC 13032-ΔargG-ΔargR- pXMJ19-argB(ec)(CIT)。因此，在重組菌CIT4中截?cái)喙习彼崂猛緩?，打通合成途徑，解除了反饋?zhàn)瓒糇饔?，?shí)現(xiàn)了L-瓜氨酸的積累，而原始菌C.glutamicumATCC 13032 不能積累L-瓜氨酸。

2.5 代謝輪廓分析指導(dǎo)下的發(fā)酵特性理性強(qiáng)化

2.5.1 中心碳代謝途徑

以CIT4為實(shí)驗(yàn)菌株，在已有的發(fā)酵培養(yǎng)基M1中，考察外源添加中心碳代謝前體對L-瓜氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知：添加丙酮酸均可有效提高L-瓜氨酸的累積，在36 h添加1.0 g/L的丙酮酸累積量達(dá)到最高，從原來的18.50 g/L提高到19.37 g/L。這是因?yàn)楸岬募尤胧沟锰剂鞲嗟牧飨騎CA循環(huán)，增加了丙酮酸生成乙酰CoA的代謝水平，減少了乙酸和乳酸等副產(chǎn)物的合成，從而提高了α-酮戊二酸的積累量。

在24 h添加1.5 g/L的α-酮戊二酸時(shí)，L-瓜氨酸的積累量最高，從原來的18.50 g/L增加到19.53 g/L。這表明外源添加促使更多的碳流經(jīng)由TCA循環(huán)進(jìn)入谷氨酸和L-瓜氨酸的合成途徑，這是因?yàn)棣?酮戊二酸是TCA循環(huán)中一個(gè)關(guān)鍵中間物質(zhì)，它可以生成L-瓜氨酸不可或缺的前體物質(zhì)谷氨酸。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，更多的α-酮戊二酸用于合成谷氨酸，使得TCA循環(huán)中α-酮戊二酸節(jié)點(diǎn)下游的代謝通量持續(xù)下降，TCA循環(huán)不暢，影響了菌體生長和維持所需的能量和必需物質(zhì)，菌體生長速率和糖耗速率減慢。

圖6 氨基酸代謝胞內(nèi)代謝物相對含量Fig.6 Amino acid metabolism intracellular metabolite relative content

圖7 在CIT4中外源添加中心碳代謝前體對L-瓜氨酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of adding precursors of central carbon metabolism on L-citrulline production in CIT4

2.5.2 氨基酸代謝途徑

根據(jù)對氨基酸代謝途徑中關(guān)鍵代謝物的動(dòng)態(tài)監(jiān)測與分析，為了提高重組菌CIT4 L-瓜氨酸的產(chǎn)量，考察外源添加氨基酸代謝物前體對L-瓜氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖8。作為L-瓜氨酸的前體物質(zhì)，谷氨酸為其提供了第1個(gè)氮原子，外源添加谷氨酸對發(fā)酵產(chǎn)L-瓜氨酸的有重要影響。由圖8可知：谷氨酸的添加使得L-瓜氨酸的積累量有一定的提高，在12 h添加1.0 g/L的谷氨酸時(shí)，其產(chǎn)量為19.65 g/L。當(dāng)谷氨酸質(zhì)量濃度超過2.0 g/L時(shí)，L-瓜氨酸的產(chǎn)量沒有明顯增加，且菌體生長時(shí)間延長，分析其原因可能是谷氨酸含量增加，使得TCA循環(huán)中α-酮戊二酸向谷氨酸合成下降，使得TCA循環(huán)更為活躍，從而增加菌體的生長。在精氨酸系列氨基酸代謝途徑中，鳥氨酸在鳥氨酸氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶(OTC，EC 2.1.3.3)催化下合成L-瓜氨酸。

鳥氨酸的加入增強(qiáng)了其與氨甲酰磷酸(Cps)的結(jié)合，繼而促進(jìn)L-瓜氨酸的合成。在12 h添加1.0 g/L的鳥氨酸時(shí)，L-瓜氨酸的產(chǎn)量為19.57 g/L(圖8(b))。

2.5.3 氨甲酰磷酸代謝途徑

在氨甲酰磷酸代謝途徑中，通過氨甲酰磷酸合成酶(UPS)催化谷氨酰胺、CO2和ATP合成L-瓜氨酸的前體物質(zhì)氨甲酰磷酸?？疾焱庠刺砑影奔柞Ａ姿岽x前體對L-瓜氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知:外源添加氨甲酰磷酸可以促進(jìn)鳥氨酸與其結(jié)合生成L-瓜氨酸，在24 h添加1.5 g/L的氨甲酰磷酸時(shí)，L-瓜氨酸的積累量最高，從原來的18.50提高到19.35 g/L。

L-谷氨酰胺是胞內(nèi)碳氮代謝的重要節(jié)點(diǎn)和重要的氨基供體，能夠參與多種細(xì)胞生長必需物質(zhì)的合成[19]。外源添加谷氨酰胺可以增加氨甲酰磷酸代謝的水平，促使合成更多的氨甲酰磷酸，并且可以競爭谷氨酸的代謝通量，減少副產(chǎn)物脯氨酸的生成，為L-瓜氨酸的累積提供更多的氮源，減少了副產(chǎn)物合成途徑的代謝流，繼而提高L-瓜氨酸的合成。在24 h添加2.0 g/L的谷氨酰胺時(shí)，L-瓜氨酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到19.58 g/L。由此可見，氨甲酰磷酸和谷氨酰胺的加入都有利于細(xì)胞的生長，特別是在0 h添加谷氨酰胺時(shí)菌體量最大，這可能是因?yàn)? h添加的谷氨酰胺更多的用于細(xì)胞的合成代謝和生長。

圖8 在CIT4中外源添加氨基酸代謝物前體對L-瓜氨酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of adding precursors of amino acid metabolism on L-citrulline production

圖9 在CIT4中外源添加氨甲酰磷酸代謝前體對L-瓜氨酸產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of adding precursors of Carbamate phosphate metabolism on L-citrulline production

2.5.4 組合優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物監(jiān)測和強(qiáng)化效果驗(yàn)證

在原有的發(fā)酵培養(yǎng)基M1基礎(chǔ)上，得到總的添加策略及優(yōu)化操作條件的新型培養(yǎng)基M2：在發(fā)酵延遲期(12 h)添加1.0 g/L的谷氨酸和鳥氨酸；在對數(shù)初期(24 h)分別添加1.5、1.5和2.0 g/L的α-酮戊二酸、氨甲酰磷酸以及谷氨酰胺。在對數(shù)中期(36 h)添加1.0 g/L的丙酮酸，結(jié)果見圖10。由圖10可知：L-瓜氨酸的產(chǎn)量從原來的18.50 g/L增加到20.86 g/L，相比原來增加12.8%。與此同時(shí)，還可發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵結(jié)束時(shí)(60 h)，檢測到乳酸、纈氨酸和賴氨酸等副產(chǎn)物的含量也減少，并且菌體生長時(shí)間增加。

圖10 CIT4在不同培養(yǎng)基(M1 和 M2)條件下 L-瓜氨酸產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.10 The dynamic changes of L-citrulline production in CIT4 under M1 and M2 media

3 結(jié)論

利用基于GC-MS的代謝組學(xué)方法研究了谷氨酸棒桿菌原始菌ATCC 13032和重組菌CIT4胞內(nèi)代謝輪廓的差異性，從代謝水平系統(tǒng)的分析高產(chǎn)L-瓜氨酸的原因。通過PCA和PLS多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明:葡萄糖、α-酮戊二酸、丙酮酸、磷酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、賴氨酸和谷氨酸這10種代謝物為潛在的生物標(biāo)志物。同時(shí)，從中心碳代謝途徑、氨基酸代謝途徑和氨甲酰磷酸代謝途徑三個(gè)方面，定時(shí)定量補(bǔ)加不同生物標(biāo)志物，研究重組菌CIT4發(fā)酵過程中L-瓜氨酸的累積量的變化。最終確定組合優(yōu)化培養(yǎng)基：在重組菌CIT4發(fā)酵延遲期(12 h)添加1.0 g/L的谷氨酸和鳥氨酸；在對數(shù)初期(24 h)分別添加1.5、1.5和2.0 g/L的α-酮戊二酸、氨甲酰磷酸以及谷氨酰胺；在對數(shù)中期(36 h)添加1.0 g/L的丙酮酸，于發(fā)酵末期(60 h)產(chǎn)物L(fēng)-瓜氨酸的產(chǎn)量從原來的18.50 g/L增加到20.86 g/L，相比原來增加12.8%。