腦特異性血管抑制因子-1在宮頸鱗癌中的表達及其與人乳頭瘤病毒感染的關(guān)系

張俊俊 王 焱 杜趁香 晉熙夢

(1.河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南洛陽 471003；2.河南科技大學第一附屬醫(yī)院婦科，河南洛陽 471003； 3.鄭州大學人民醫(yī)院產(chǎn)科，鄭州 450003)

子宮頸癌(cervical cancer)在中國發(fā)生率居女性生殖器惡性腫瘤的首位，以鱗癌為主，其發(fā)病率、病死率近年均有升高趨勢，且發(fā)病年齡年輕化[1-2]，嚴重威脅著我國女性的健康及生命安全[3]。子宮頸癌的發(fā)生及進展是一個多因素、多步驟參與的復雜過程，目前研究[4-5]已證實高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染是導致宮頸癌發(fā)生的最主要原因，99.7%的宮頸癌患者中能檢測到HPV-DNA的存在[6]。目前雖然宮頸癌篩查技術(shù)有所提高及預(yù)防性HPV疫苗的應(yīng)用，但仍存在假陰性的問題且預(yù)防性疫苗對已經(jīng)存在的HPV感染和HPV相關(guān)的病變沒有治療作用[7]；在臨床治療中，宮頸癌的治療主要依賴于手術(shù)根治及結(jié)合放射治療和化學藥物治療(以下簡稱放化療)的綜合治療等，但對于臨床上大多數(shù)宮頸癌晚期及復發(fā)的患者，仍缺乏行之有效的治療手段，因此尋找新的且確切的防治方法仍是我國面臨的巨大難題。近年研究[8]顯示，腦特異性血管抑制因子-1(brain-specific angiogenesis inhibitor-1，BAI-1)主要通過抑制由成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)誘發(fā)的血管新生生成起作用，并且與多種惡性腫瘤關(guān)系密切；而且研究[9-11]表明BAI-1及HPV16E6/E7均與P53及FGF關(guān)系密切，猜測兩者之間可能存在某種聯(lián)系，而且目前尚無關(guān)于BAI-1在宮頸鱗癌方面的研究及與HPV感染關(guān)系的探討。本研究通過SP法觀察BAI-1因子在正常宮頸組織、宮頸癌前病變組織及宮頸鱗癌組織中的表達情況及與HPV感染的關(guān)系，探討其與HPV導致的宮頸鱗癌發(fā)生、進展的關(guān)系。為宮頸鱗癌的防治及評估預(yù)后提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸標本來源于2014年10月至2016年10月河南科技大學第一附屬新區(qū)醫(yī)院中病例保存較完整，且患者術(shù)前均未行新輔助放化療治療的經(jīng)宮頸活檢及手術(shù)切除的宮頸組織，所有取材患者均在無其他治療的情況下進行PCR反向點雜交法分型檢測宮頸HPV-DNA感染情況，經(jīng) HE染色(圖1)證實為宮頸鱗癌54例(經(jīng)手術(shù)及活檢術(shù))，宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ27例(經(jīng)宮頸活檢術(shù))，CINⅡ～Ⅲ34例(經(jīng)宮頸錐切術(shù))，并收集同時間段30例來源于河南科技大學第一附屬新區(qū)醫(yī)院因患子宮肌瘤行子宮全切的正常宮頸組織作為對照；所有標本取材均通過醫(yī)院倫理委員會許可。對54例宮頸鱗癌分組：臨床分期(按2009年國際婦產(chǎn)科協(xié)會分期標準[12])：Ⅰ～Ⅱ期的34例，Ⅲ～Ⅳ期的有20例；分化程度：高分化28例，中～低分化26例；淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移(Ⅰ～Ⅱ期進行手術(shù)的34例經(jīng)病理學診斷明確指出有無淋巴結(jié)移轉(zhuǎn)的宮頸鱗癌患者)：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有15例，有轉(zhuǎn)移則有19例。所有標本均經(jīng)過通用常規(guī)的10%(體積分數(shù))中性甲醛預(yù)先固定、常規(guī)石蠟包埋、4 μm厚連續(xù)切片處理，本實驗的所有病理切片均經(jīng)本院病理科的兩到三位高年資主任醫(yī)師相互印證后以明確診斷。

1.2 免疫組織化學檢測

本實驗的標本均經(jīng)石蠟包埋，嚴格切片后經(jīng)脫蠟、脫水、加熱等處理，后滴加一抗，進行免疫組織化學染色(Envision法)，實驗步驟嚴格按試劑盒要求規(guī)范操作，本實驗所用的BAI-1兔抗人多克隆抗體 (1∶100)購于美國Santa Cruz公司；二抗購于北京中杉金橋技術(shù)有限公司。以PBS替代一抗作為陰性對照。

圖1 不同病變宮頸組織HE染色Fig.1 HE staining of different cervical lesions tissues(200×)

A: positive expression of BAI-1 in cervical intraepithelial neoplasia I tissue;B: positive expression of BAI-1 in cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ tissue;C:positive expression of BAI-1 in cervical squamous cell carcinoma tissue;BAI-1:brain-specific angiogenesis inhibitor-1.

1.3 結(jié)果判斷

在宮頸組織中BAI-1的陽性表達主要定位于細胞質(zhì)及胞膜中，按染色的強弱及陽性細胞計數(shù)評分如下：棕褐色、棕黃色、淡黃色和無著色分別計為3、2、1、0分；每個高倍鏡視野計數(shù)細胞100個，隨機觀察10個視野，取其平均值，按照0分：≤10%，1分：11% ～50%，2分：51%～80%， 3分：>80%；將兩項得分結(jié)果相乘的結(jié)果作為最終評分，>3為陽性，≤3為陰性[13]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料用頻數(shù)和百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。采用Spearman 相關(guān)系數(shù)表示兩變量的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BAI-1在宮頸不同病變組織中的表達

BAI-1的陽性表達主要定位于胞質(zhì)和胞膜 (圖2)。BAI-1 在正常宮頸組織、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中的陽性率逐步降低，分別為 96. 67%、74. 07%、44.11%、18.52.%，BAI-1在4組間的表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=54.232，P=0.000)；且BAI-1在正常宮頸組織中的陽性表達(96. 67%)顯著高于CIN Ⅰ(74. 07%)、CINⅡ～Ⅲ(44.11%)及宮頸鱗癌組(18.52.%)，任意兩組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見表1。

2.1 BAI-1的表達及與宮頸鱗癌各項臨床病理指標的相關(guān)性

BAI-1在宮頸鱗癌中陽性表達與患者年齡、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，而與臨床分期有關(guān)(χ2=7.219，P=0.007)，詳見表2。

2.3 高危HPV-DNA在不同宮頸組織中的感染情況

高危HPV-DNA在正常宮頸組織、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌中的感染率逐步升高，分別為6.67%、37.04 %、76.47%、100%，在4組間的表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=83.423，P=0.000)；且高危HPV-DNA在宮頸鱗癌組織中的陽性感染率(100%)顯著高于正常宮頸(6.67%)、CIN Ⅰ(37.04%)及CINⅡ～Ⅲ組(76.47%)，任意兩組間比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見表3。

圖2 BAI-1在宮頸不同病變組織中的免疫組織化學檢測結(jié)果Fig.2 BAI-1 immunohistochemical results of different cervical lesions tissues(200×)

A: positive expression of BAI-1 in normal cervical tissue;B: positive expression of BAI-1 in intraepithelial neoplasia I tissue;C:positive expression of BAI-1 in cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ tissue;D: positive expression of BAI-1 in cervical squamous cell carcinoma tissue；BAI-1:brain-specific angiogenesis inhibitor-1.

表1 BAI-1在宮頸不同病變組織中的表達Tab.1 The staining of BAI-1 in the different degree of cervical lesions tissues

表2 BAI-1的表達情況及與宮頸鱗癌臨床病理特征的相關(guān)性Tab.2 Correlation between BAI-1 expression and clinicopathologic characteristics ofcervical squamous cell carcinoma

表3 高危HPV-DNA在不同宮頸組織中的結(jié)果Tab.3 Staining of HPV-DNA in the different cervical tissues

2.4 HPV感染與BAI-1表達的相關(guān)性分析

實驗研究得出在正常的宮頸組織、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ到宮頸鱗癌癌變的過程中，通過Spearman相關(guān)性分析， BAI-1在不同宮頸組織中的表達與HPV感染呈負相關(guān)(rs=-0.486，P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義(表4)。

表4 BAI-1表達與HPV感染的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between the expression ofBAI-1 and HPV infection

BAI-1: brai-specific angiogenesis inhibitor-1;HPV：human papillomavirus.

3 討論

細胞生長的能量主要來源于血液供應(yīng)，而不斷新生的血管則為惡性腫瘤的生長、侵襲提供必備的條件，如能阻礙腫瘤內(nèi)血管的生成則能有效遏制腫瘤的生長[14]。在細胞癌變過程中，腫瘤新生血管能夠為腫瘤細胞的增生、轉(zhuǎn)移提供有利條件，研究[15]顯示其在宮頸病變逐步進展的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。近年來，隨著宮頸癌防治及預(yù)后的進一步研究，腫瘤血管相關(guān)因子逐漸成為研究熱點。腫瘤新生血管生成是一個多因素影響的復雜過程，在已知的血管相關(guān)因子中，目前尚無宮頸癌中BAI-1血管相關(guān)因子及與HPV感染的相關(guān)性研究，本文通過檢測BAI-1在不同宮頸病變中的表達及與HPV感染的情況，探討B(tài)AI-1與HPV感染所致的宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

作為一種新型靶基因，BAI-1是G蛋白偶聯(lián)受體的分泌素受體家族中的一種多重跨膜蛋白，在1997年研究P53時被發(fā)現(xiàn)[16]，屬于P53的下游分子，主要受野生型P53的調(diào)控而發(fā)生作用，因能夠遏制血管再生而開始被關(guān)注。在大多數(shù)正常組織如乳腺、腎臟、胰腺等中也發(fā)現(xiàn)了BAI-1的存在，而在相應(yīng)的惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)其表達明顯下調(diào)甚至缺如[17-19]。2003年研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中BAI-1多數(shù)不表達或表達極低，幾乎不表達于轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，同時可以抑制腫瘤新生血管生成，有效的減緩腫瘤的生長[20]。BAI-1是具有5個血小板敏感蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)重復序列的血管生成抑制因子，一方面其可通過TSP1抑制由FGF誘發(fā)的血管生成，從而發(fā)揮抑癌作用[21]；另一方面其屬于P53的下游分子，分子結(jié)構(gòu)內(nèi)至少含有一個功能性的P53結(jié)合序列位點，并且只受野生型P53的表達調(diào)控，而在變異P53組織中無表達；通過該功能位點與P53結(jié)合，可激活P53/BAI-1通路從而發(fā)揮抑癌作用[22-23]。本研究結(jié)果顯示，在正常宮頸組織、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中BAI-1的陽性表達逐漸降低，組間差異均有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)，并且BAI-1與宮頸鱗癌臨床分期密切相關(guān)，分期越早，其陽性表達率越高，且在有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達明顯偏低，提示其可能參與宮頸鱗癌病變的早期事件。

研究[24]證實高危HPV的持續(xù)感染導致宮頸癌的發(fā)生，其中最常見的為HPV16，其HPV-DNA中與致癌性密切相關(guān)的主要是早期轉(zhuǎn)錄基因中的E6、E7。 E6蛋白通過特異性綁合p53蛋白，使其失去活性并快速降解或表達下調(diào)，致細胞原有周期失去控制，細胞增生失控。E7蛋白通過作用于E2F和pRB形成的復合物，使其發(fā)生降解，致細胞周期失控并永生化； 同時HPVE7 基因下游的核糖核苷酸還原酶亞基M2 基因能與E7 和RB 蛋白結(jié)合釋放的轉(zhuǎn)錄因子 E2F結(jié)合刺激活性氧的生成，而活性氧能激活ERK1/2 信號通路，使低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α)和FGF 表達上調(diào)來促進血管新生，最終導致癌癥的發(fā)生[10-11]。考慮BAI-1及HPV 16 E6/E7均與P53及FGF關(guān)系密切，推測兩者之間在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中可能存在某種關(guān)系，而本實驗結(jié)果顯示BAI-1的表達與HPV的感染呈負相關(guān)，考慮其可能的機制為：①HPVE6蛋白通過與P53結(jié)合誘導P53降解或表達下調(diào)，從而抑制P53對BAI-1的調(diào)控，導致BAI-1表達下調(diào)；②HPV E7蛋白和RB 蛋白結(jié)合激活ERK1/2 信號通路從而誘導FGF 的表達上調(diào)，而過表達的FGF可能被含有5個TSP-1結(jié)構(gòu)的BAI-1抑制，刺激更多活性氧的生成，從而抑制HPVE7蛋白的表達。

綜上所述，BAI-1在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中的陽性表達率逐漸降低，且與宮頸鱗癌的臨床分期密切相關(guān)，同時與高危HPV的陽性感染率呈負相關(guān)；由此可推測 BAI-1可能參與HPV導致的宮頸鱗癌的早期病變過程，有望成為宮頸鱗癌靶向基因治療的新方向，為宮頸鱗癌的早期防治及預(yù)后評估提供新的思路。