脂多糖對腸道α-突觸核蛋白表達的影響

劉夢茹 宮曉麗 王 樂 劉 玚 張 婷* 王曉民*

(1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經(jīng)生物學系， 北京 100069；2.首都醫(yī)科大學教育部神經(jīng)變性病重點實驗室， 北京 100069；3，首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理與病理生理學系， 北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種運動癥狀伴發(fā)非運動癥狀的全身性疾病，在65歲以上的中老年人群中發(fā)病率僅次于阿爾茲海默癥，位居第二。靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和姿勢不穩(wěn)是PD后期的主要運動功能障礙的表現(xiàn)，所以PD患者在中晚期時沒有能力自己照料生活，給患者的家庭和社會帶來了沉重的負擔。從PD被發(fā)現(xiàn)至今已201年，但其發(fā)病機制仍不明確。

一直以來，中腦黑質(zhì)部位多巴胺神經(jīng)元的進行性死亡和以α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)為主要組成成分聚集而成的路易小體的出現(xiàn)是PD的主要病理表現(xiàn)。近年來的研究[1]顯示除了運動障礙之外，PD患者還表現(xiàn)出一些非運動癥狀，包括：嗅覺減退、失眠、心悸、便秘、抑郁、癡呆等。有文獻[1-2]顯示，在PD臨床癥狀確診前20年，便可檢測到胃腸道組織中發(fā)生α-syn的聚集或出現(xiàn)路易小體，并伴有便秘、胃食管反流等非運動癥狀，隨時間的延長胃腸道的功能障礙會不斷加重。另有研究[3-4]表明A53T 和 A30P 突變型的α-syn轉(zhuǎn)基因小鼠胃、結(jié)腸、回腸組織均出現(xiàn)α-syn蛋白的異常聚集，且早于中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生。

炎性反應是PD發(fā)病進程中的早期重要影響因素。在PD患者和動物模型中，腦內(nèi)唯一的固有免疫細胞——小膠質(zhì)細胞發(fā)生激活，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等促炎因子大量釋放。對PD患者外周組織的臨床研究[5]也顯示，PD患者的胃腸道炎性反應水平顯著升高。然而，外周炎性反應與胃腸道組織內(nèi)α-syn蛋白表達的關系，目前仍不明確。本研究利用腹腔注射細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)構建炎性反應誘導的PD小鼠模型，觀察炎性反應急性期和慢性期小鼠結(jié)腸內(nèi)源性α-syn的表達，以及胃腸道組織內(nèi)炎性反應小體NOD樣受體家族蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)和TNF-α的水平。

1 材料和方法

1.1 動物

雄性C57BL/6J小鼠購買和飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學動物部SPF級小鼠飼養(yǎng)室，實驗動物許可證號為SYXK(京)2018-0002。每籠小鼠不超過5只，室內(nèi)溫度控制在(23 ± 2) ℃，濕度50%～55 %，并保持12 h/12 h晝夜循環(huán)，小鼠可以自由飲水和攝食。本實驗所有操作均符合《中華人民共和國動物保護法》，并通過首都醫(yī)科大學動物倫理委員會的批準。

1.2 模型制備及分組

將野生型C57BL/6J小鼠采用數(shù)字表法隨機分為0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液對照組和LPS模型組，模型組小鼠按照體質(zhì)量單次腹腔注射5 mg/kg的LPS(購自美國Sigma公司)，注射體積為0.2 mL，對照組注射相同體積的0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液，每組20只。LPS注射后1、3、12 h和1個月后分別取3～6只小鼠進行實驗。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附反應法檢測TNF-α

取模型組和對照組小鼠的外周血，將血樣本在37 ℃孵箱內(nèi)孵育30 min，隨后放入4 ℃離心機內(nèi)以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清使用雙抗夾心法TNF-α ELISA試劑盒(購自上海依科賽公司)測量各組小鼠血液中TNF-α蛋白含量，用多功能酶標儀(Spectra Max Paradigm I3,美國Molecular Devices公司)測量標準品和樣本在540 nm吸收峰檢測吸光度值，根據(jù)標準品濃度計算出樣本的濃度。

1.4 Western blotting法檢測蛋白濃度

在LPS注射3 h后，取對照組和模型小鼠結(jié)腸組織，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解，剪刀剪碎組織，用超聲裂解后室溫靜置30 min，4 ℃離心機以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后取上清，用BCA法測定各組中蛋白的濃度。將蛋白按4∶1加入SDS上樣緩沖液，95 ℃變性5 min，混勻后得到配制好的上樣蛋白樣本。將等量蛋白上樣樣本按順序緩慢勻速加入聚丙烯凝膠的孔中，恒壓120 V電泳、恒流200 mA電轉(zhuǎn)180 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到孔徑為0.22 μm的硝酸纖維素膜上，封閉液室溫孵育1 h，一抗α-syn抗體(1∶1 000，購自美國BD公司)、NLRP3抗體(1∶200，購自美國Sigma公司)、內(nèi)參抗體ACTIN(1∶3 000，購自美國Sigma公司)依次孵育，4 ℃冰箱過夜。隨后室溫避光孵育二抗1 h，然后PBST洗膜3次，每次5 min，最后用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(美國Licor公司)進行掃描成像，用Image J軟件統(tǒng)計條帶。

1.5 RT-qPCR法檢測TNF-α的mRNA

在LPS注射1 h后，取對照組和模型小鼠結(jié)腸組織，用Trizol法提取組織總mRNA，用Nanodrop 微量分光光度計(Nano Drop 2000, 美國Thermo公司)檢測mRNA濃度。使用Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit試劑盒(購自美國NEB公司)，建立總體積為20 μL的RT-qPCR反應體系，QuantStudio 5 實時定量PCR儀中進行RT-qPCR反應。引物序列分別為：m- TNF-α 上游引物：5′-CCAGTGTGGGAAGCTGTCTT-3′，m-TNF-α 下游引物：5′- AAGCAAAAGAGGAGGCAACA-3′；m-GAPDH 上游引物：5′- AGAACATCATCCCTGCATCC-3′，m-GAPDH 下游引物：5′- CACATTGGGGGTAGGAACAC -3′。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 LPS腹腔注射引起小鼠外周血TNF-α增加和體質(zhì)量下降

在LPS腹腔注射后12 h和1個月后,分別對小鼠的體質(zhì)量進行檢測，同時取血清進行ELISA檢測TNF-α濃度。結(jié)果顯示LPS模型組的小鼠體質(zhì)量在腹腔注射后12 h下降至對照組小鼠體質(zhì)量的91.79 %[(25.17 ± 0.85)gvs(22.13 ± 0.64)g]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1),而注射后1個月的小鼠體質(zhì)量恢復至正常水平。同時，用ELISA的方法檢測小鼠血清中炎性反應因子TNF-α的變化情況，結(jié)果表明在LPS腹腔注射后1 h血清TNF-α較對照組迅速升高了17.3倍[(24.67 ± 21.70)pg·μL-1vs(427.90 ± 291.6)pg·μL-1]，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.015)，在1個月后恢復至正常水平，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

2.2 LPS注射后急性期結(jié)腸α-syn、NLRP3 和TNF-α表達增加

取腹腔注射LPS的模型小鼠結(jié)腸組織，通過Western blotting檢測α-syn和炎性反應小體NLRP3的蛋白表達情況，結(jié)果顯示LPS注射后3 h結(jié)腸內(nèi)NLRP3的表達較對照組升高了(1.079 ± 0.26)倍(P=0.002)，α-syn蛋白較對照組升高了(0.33 ± 0.12)倍(P=0.010 1)，說明LPS可以刺激結(jié)腸的α-syn蛋白表達，同時伴隨著炎性反應小體的激活。隨后用RT-qPCR的方法檢測炎性反應因子TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示TNF-α的mRNA在注射后1 h明顯升高了(34 ± 4.30)倍(P=0.000 3)(圖2)。以上結(jié)果說明，LPS刺激了結(jié)腸內(nèi)α-syn的蛋白表達，激活了結(jié)腸炎性反應小體，促進了炎性反應因子TNF-α的表達。

圖1 LPS腹腔注射引起小鼠外周血TNF-α增加和體質(zhì)量下降Fig.1 LPS increased serum TNF-α level and decreased body weight

C57BL/6J mice were injected with LPS (5 mg/kg) intraperitoneally or saline as control group. Body weights were measured at 12 hours post-LPS injection(A). TNF-α protein in serum was tested at 1 hour post-LPS injection (B). Body weights (C) and TNF-α protein in serum (D) were also measured at 1 month post-LPS injection. Data were analyzed by unpaired Student’st-test.**P<0.01,***P<0.001vsNS group;LPS:lipopolysaccharide;NS:normal saline；TNF-α：tumor necrosis factor-α.

2.3 LPS注射后1個月結(jié)腸α-syn和NLRP3恢復，而TNF-α表達仍增高

LPS注射后1個月，檢測小鼠結(jié)腸組織內(nèi)α-syn和NLRP3的蛋白表達情況，結(jié)果顯示α-syn的蛋白表達較對照組無明顯改變，同時炎性反應小體NLRP3差異無統(tǒng)計學意義。隨后用RT-qPCR的方法檢測結(jié)腸內(nèi)TNF-α的mRNA水平，LPS注射組較對照組仍升高了(21.3 ± 10.92)倍(P=0.027 9)(圖3)。以上結(jié)果說明LPS注射小鼠的結(jié)腸組織，在慢性期α-syn表達恢復至正常水平，炎性反應小體也恢復，但結(jié)腸組織局部炎性反應因子TNF-α仍處于較高水平。

3 討論

PD是一種運動癥狀伴發(fā)非運動癥狀的全身性疾病，其病理改變主要表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失和α-syn異常聚集形成的路易小體。2010年Kalia等[6]和Hawkes等[7]依據(jù)PD患者的組織學研究結(jié)果和臨床表現(xiàn)提出假說認為，PD患者的非運動癥狀，如便秘、胃食管反流等癥狀可能早于運動癥狀20年發(fā)生，并伴有胃腸道內(nèi)α-syn的聚集。但至今，PD的發(fā)病機制仍不清楚，胃腸道α-syn異常的原因不明。

α-syn是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)突觸前膜末梢的小分子可溶性蛋白，由140個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為19 000, 結(jié)構上相對保守，主要分為囊泡結(jié)合型和膜結(jié)合型。α-syn的氨基酸序列可分為3個區(qū)域：氨基端，含有KTKEGV重復序列，易形成兩性α螺旋；中間部NΑC區(qū)域，其疏水區(qū)易形成β片層結(jié)構，在體外極易聚集，且可促進α-syn的聚集；羧基端主要由酸性氨基酸組成，帶有大量負電荷，具有較強的親水性。α-syn豐富表達在神經(jīng)元內(nèi)，但在肌肉、血細胞等組織細胞中也有表達[8]。

PD是一種神經(jīng)退行性疾病，其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失以及α-syn異常聚集形成路易小體。PD癥狀分為運動癥狀和非運動癥狀，運動癥狀表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直等，非運動癥狀表現(xiàn)有胃食管反流、便秘、嗅覺障礙等[9]。在PD相關因素調(diào)查中，便秘與PD患病的相關性，是性別因素和年齡因素與PD發(fā)病相關性的6倍。腸道運動頻率與PD患病率呈負相關。在PD發(fā)病的每個階段都伴隨著胃腸道損傷，尤其對于晚期PD患者胃腸癥狀變得更加嚴重[10-12]。臨床數(shù)據(jù)[13]顯示PD患者腸道通透性較對照組明顯增高，這一現(xiàn)象與PD患者腸道大腸桿菌、血中脂多糖結(jié)合蛋白水平以及α-syn蛋白表達的增加密切相關。動物實驗中也發(fā)現(xiàn)從LPS腹腔注射后2個月，小鼠腸道通透性開始增加同時伴隨α-syn蛋白表達增多，且具有時間依賴性[14]。LPS腹腔注射后7個月，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目降低了23%，10個月時降低了47%[15]。同時還伴隨著運動行為的改變。因此研究LPS誘導的炎性反應對于腸道α-syn表達的影響在PD發(fā)病早期腸道通透性增強等非運動癥狀的發(fā)生中具有重要的理論價值，同時也對PD的早期診斷具有重要的意義。

圖2 LPS注射后急性期結(jié)腸α-syn、NLRP3 和TNF-α表達增加Fig.2 In the acute phase, LPS increased the expression of α-syn, NLRP3 and TNF-α in the intestine

The expression of α-syn and NLRP3 protein in the intestine were measured by Western blotting at 3 hours post-LPS injection (A-C). The mRNA level of TNF-α (D) was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction at 1 hour after LPS injection. Data were analyzed by unpaired Student’st-test.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsNS group;LPS:lipopolysaccharide;NS:normal saline；NLRP3:NOD-like receptor protein 3;TNF-α：tumor necrosis factor-α;α-syn:α-synuclein;GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

圖3 LPS注射后1個月結(jié)腸α-syn和NLRP3恢復，而TNF-α表達仍增高Fig.3 Expression of α-syn and NLRP3 were recovered, while TNF-α still increased in theintestine at one month after LPS injection

The expression of α-syn (A,B) and NLRP3 protein (C,D) in the intestine were measured by Western blotting at one month post-LPS injection. The mRNA level of TNF-α (E) was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction. Data were analyzed by unpaired Student’st-test,*P<0.05vsNS group;LPS:lipopolysaccharide;NS:normal saline；α-syn:α-synuclein;NLRP3:NOD-like receptor protein 3;TNF-α：tumor necrosis factor-α.

筆者給予野生C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS后發(fā)現(xiàn)在急性反應期小鼠腸道內(nèi)α-syn蛋白較對照組明顯的增多，同時也伴隨著炎性反應小體NLRP3和炎性反應因子TNF-α的表達增加，在LPS注射后一個月結(jié)腸α-syn的表達恢復接近至正常水平，但腸道組織TNF-α持續(xù)的高表達，還未有文獻報道。提示腸道組織很可能與腦組織作用原理相似，LPS誘導的TNF-α持續(xù)的高表達導致LPS慢性反應期(注射后2～5個月)腸道α-syn表達增加、神經(jīng)元丟失以及引起腸道功能障礙。該研究為炎性反應對PD早期腸道功能障礙的影響提供可能的理論依據(jù)。也為進一步的解釋PD關鍵致病蛋白α-syn的機制、病理診斷和治療提供可能的依據(jù)。