綠豆活性肽對小鼠H22肝癌移植瘤的抑制作用

李梅青，王 康，夏善偉，周 鑫

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2 合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽 合肥 230036)

綠豆(mung bean)又名青小豆，為豆科草本植物綠豆(Phaseolusradiatus)的成熟種子，其營養(yǎng)成分豐富[1]，蛋白質(zhì)含量高達19.5%～33.1%[2]，并且具有抗氧化、抗真菌、降血壓、降血脂、參與人體代謝以及解毒等多種生理功能[3-8]。綠豆作為我國主要的豆類糧食作物，其栽培面積、總產(chǎn)量和出口量曾居世界首位，品種更是達數(shù)千種之多[9]。近年來，人們對綠豆的加工利用多集中于淀粉生產(chǎn)方面，而忽略了蛋白質(zhì)，造成了蛋白質(zhì)資源的嚴重浪費[10]。

肝癌是常見的惡性腫瘤，其死亡率高[11-13]，而且目前的主要治療手段副作用巨大[14-15]。由非單一氨基酸組成的活性肽類是近幾年抗腫瘤研究的熱點，國內(nèi)外專家研究發(fā)現(xiàn)，許多活性肽類有很好的腫瘤抑制作用，且對人體毒副作用較小[16-18]。綠豆活性肽是綠豆蛋白水解后的產(chǎn)物，具有抗氧化[19]、降血壓[20]、提高免疫力[21]等功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，綠豆活性肽能顯著抑制人肝癌細胞HepG2的體外增殖活性，其作用效果與靈芝肽相當[22]，遠高于玉米肽[23]。為了更加深入地了解綠豆活性肽的體內(nèi)腫瘤抑制作用，本試驗利用荷瘤小鼠考察綠豆活性肽對小鼠移植性腫瘤H22的體內(nèi)抑制活性，并初步探究其作用機制，旨在為綠豆資源的深度利用和綠豆活性肽在肝癌飲食預(yù)防以及病患輔助食品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑及儀器 綠豆分離蛋白，購自河南千志商貿(mào)有限公司；木瓜蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；小鼠端粒酶(TE)、小鼠B細胞淋巴瘤因子(Bcl-2)、小鼠Bcl-2相關(guān)蛋白(Bax)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(ELISA)，伊萊瑞特生物科技有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)檢測試劑盒，利德曼生化股份有限公司；5-氟尿嘧啶(5-FU)，上海瑞永生物科技有限公司。

Alphal-2冷凍干燥機，英國LABCONCO公司；酶標儀，美國Bio-Rad公司；SC-2556低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KM-23vet全自動血細胞分析儀，上?？得泪t(yī)療器械有限公司；AU680全自動生化分析儀，貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司。

1.1.2 試驗動物與瘤株 無特定病原體(SPF)級昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g/只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物合格證號為SCXK(滬)2012-0002。鼠肝癌H22瘤株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)張勁松教授惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠豆活性肽的制備 配制質(zhì)量濃度為50 g/L的綠豆分離蛋白溶液，在木瓜蛋白酶的作用下進行水解(52 ℃，pH 6.3，酶用量4 500 U/g，酶解2 h)，期間不斷以0.5 mol/L的NaOH溶液滴定以維持pH恒定。酶解后沸水浴10 min滅酶，調(diào)節(jié)pH至綠豆分離蛋白等電點pI為 4.4[24]，沉淀未水解的蛋白，4 200 r/min離心15 min，取上清液冷凍干燥得到粉末多肽。

1.2.2 動物模型的建立和受試方式 將48只小鼠隨機分為6組，即正常組、模型組、陽性對照組及綠豆活性肽高、中、低劑量組，每組8只。無菌條件下抽取傳代7 d、生長良好的H22荷瘤小鼠腹水，用生理鹽水稀釋至細胞密度為2×107mL-1，按0.2 mL/只在小鼠的右前肢腋部皮下注射接種上述除正常組外的其他各組小鼠。從接種后第2天開始，連續(xù)給藥7 d，綠豆活性肽高、中、低劑量組分別灌胃不同質(zhì)量濃度的綠豆活性肽溶液0.2 mL/只，灌胃劑量分別為400，800和1 600 mg/kg；陽性對照組以20 mg/kg劑量腹腔注射5-FU；正常組和模型組灌胃等體積(0.2 mL)生理鹽水溶液。末次給藥24 h后稱小鼠體質(zhì)量，麻醉，摘除眼球采集血液樣本后處死，完整剝離小鼠腫瘤組織、脾臟和胸腺，備用。

1.2.3 抑瘤率和免疫器官臟器指數(shù)的測定 用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水清洗腫瘤組織、脾臟、胸腺表面的血跡和組織液后稱質(zhì)量，按照公式(1)、(2)、(3)分別計算抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

(1)

(2)

(3)

1.2.4 血液生化指標的測定 采用全自動血細胞分析儀測定小鼠血液中白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)和血小板(PLT)含量；離心收集血清，通過全自動生化分析儀測定小鼠血清中AST、ALT、ALP活性及BUN和CRE含量。

1.2.5 TE、Bcl-2和Bax的測定 將腫瘤組織樣本剪碎，稱取0.1 g，與0.9 mL PBS(0.01 mol/L，pH=7.4)充分混合后，置于冰上用高速組織勻漿器勻漿，將勻漿液于5 000 r/min離心10 min，按照ELISA試劑盒說明書對腫瘤組織中TE、Bax和Bcl-2的含量進行測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，檢測結(jié)果均采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆活性肽對荷瘤小鼠的抑瘤率

由表1可知，陽性對照組和綠豆活性肽高、中、低劑量組荷瘤小鼠瘤質(zhì)量均低于模型組，其中高、中、低劑量組與模型組差異達顯著水平(P<0.05)，陽性對照組與模型組差異達極顯著水平(P<0.01)，說明陽性對照組藥物和綠豆活性肽對荷瘤小鼠腫瘤的生長均有明顯的抑制作用。隨著使用劑量的增加，綠豆活性肽對腫瘤的抑制效果也逐漸增強，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。綠豆活性肽高、中、低劑量組均能不同程度增加荷瘤小鼠體質(zhì)量，而陽性對照組小鼠體質(zhì)量極顯著低于模型組，說明陽性對照組藥物對荷瘤小鼠機體存在明顯的損傷，嚴重影響荷瘤小鼠的生長。

表1 綠豆活性肽對荷瘤小鼠的抑瘤率(n=8)Table 1 Anti-tumor effect of mung bean peptides against tumor-bearing mice (n=8)

注：*表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note: * means significant differences compared with model groups(P<0.05),** means very significant differences compared with model groups(P<0.01).The same below.

2.2 綠豆活性肽對荷瘤小鼠免疫器官的影響

研究發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠的胸腺常出現(xiàn)萎縮，而免疫促進劑可使其質(zhì)量恢復(fù)至正常水平。在癌變過程中，因肝臟正常血管結(jié)構(gòu)被破壞，受門脈高壓形成及機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響，最終會造成脾臟增大[25]。由表2可知，與模型組相比，陽性對照組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均極顯著降低，說明5-FU對小鼠具有明顯的免疫抑制作用；綠豆活性肽高、中、低劑量組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均較模型組升高，其中中、高劑量組脾臟指數(shù)與模型組差異達顯著水平，說明綠豆活性肽能夠增大小鼠免疫器官的質(zhì)量，增強小鼠的免疫功能。與正常組相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低，脾臟指數(shù)顯著升高。

表2 綠豆活性肽對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(n=8)Table 2 Effect of mung bean peptides on thymus index and spleen index of tumor-bearing mice (n=8) mg/g

注：模型組與正常組相比，數(shù)據(jù)后標#表示差異顯著(P<0.05)，標##表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note: # means significant difference between the model group and the normal group(P<0.05),## means very significant difference between the model group and the normal group(P<0.01).The same below.

2.3 綠豆活性肽對荷瘤小鼠血液常規(guī)指標的影響

小鼠血液WBC、RBC、HGB和PLT水平的檢測結(jié)果如表3所示。由表3可知，與正常組相比，模型組小鼠WBC和PLT水平分別顯著和極顯著升高，RBC和HGB水平無明顯變化。陽性對照組小鼠WBC和PLT水平極顯著低于模型組。與模型組相比，綠豆活性肽高、中、低劑量組小鼠WBC水平升高，其中中、高劑量組與模型組差異達顯著水平；PLT水平降低，其中中、高劑量組與模型組差異達顯著水平；RBC和HGB水平無明顯變化。上述結(jié)果表明，綠豆活性肽能升高荷瘤小鼠的WBC水平，增強機體免疫力。

表3 綠豆活性肽對荷瘤小鼠血液常規(guī)指標的影響(n=8)Table 3 Effect of mung bean peptides on haematology index in tumor-bearing mice (n=8)

2.4 綠豆活性肽對荷瘤小鼠肝臟和腎臟功能血清指標的影響

血清中AST、ALT和ALP活性的升高常被作為肝臟功能受損的特異性指標，而BUN和CRE含量的升高是腎臟功能受損的重要指標[26]。由表4可知，與正常組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT和ALP活性均極顯著升高，BUN和CRE含量無明顯變化，說明H22腫瘤能造成小鼠肝組織損傷，對腎臟無明顯影響。與模型組比較，綠豆活性肽高、中、低劑量組小鼠血清中AST、ALT和ALP活性均下降，其中低劑量組與模型組差異達顯著水平，中、高劑量組與模型組差異達極顯著水平；陽性對照組荷瘤小鼠血清中AST、ALT、ALP活性及BUN和CER含量均較模型組升高，其中AST、BUN和CRE與模型組差異達顯著水平，ALT和ALP與模型組差異達極顯著水平。表明抗癌藥物5-FU在發(fā)揮治療作用的同時，對機體的肝臟和腎臟具有明顯的損害作用，而綠豆活性肽能顯著改善腫瘤對荷瘤小鼠所致的肝組織損傷。

表4 綠豆活性肽對荷瘤小鼠肝臟和腎臟功能血清指標的影響(n=8)Table 4 Effect of mung bean peptides on serum indexes of hepatic and renal functions in tumor-bearing mice (n=8)

2.5 綠豆活性肽對荷瘤小鼠腫瘤組織Bax、Bcl-2表達和TE活性的影響

由表5可知，與模型組比較，陽性對照組和綠豆活性肽高、中、低劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織中TE水平極顯著下降；Bax水平上升，其中陽性對照組和綠豆活性肽高劑量組與模型組差異達極顯著水平，綠豆活性肽中劑量組與模型組差異達顯著水平；Bcl-2水平下降，其中陽性對照組與模型組差異達極顯著水平，綠豆活性肽高、中劑量組與模型組差異達顯著水平。

表5 綠豆活性肽對荷瘤小鼠腫瘤組織Bax、Bcl-2表達和TE活性的影響(n=8)Table 5 Effect of mung bean peptides on Bax,Bcl-2 and TE in tumor tissue (n=8)

以上結(jié)果說明，陽性對照組藥物和綠豆活性肽均能抑制TE活性，降低Bcl-2蛋白表達，增強Bax蛋白表達，其中陽性對照組藥物作用效果最為明顯，符合表1中抑瘤率測定結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

端粒酶在維持癌細胞無限增殖的過程中發(fā)揮著重要作用，抑制端粒酶的活性有可能抑制癌的發(fā)生與發(fā)展，端粒酶被認為是預(yù)防和治療癌癥的新靶標[27]。韓雅莉等[28]研究發(fā)現(xiàn)，地鱉纖溶活性蛋白對H22實體瘤有一定的抑制作用，其通過降低端粒酶活性、提高Caspase-3表達水平，來誘導(dǎo)癌細胞凋亡。Bcl-2和Bax是近年研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤細胞凋亡明確相關(guān)的2類蛋白，在細胞凋亡的調(diào)控中扮演著重要角色，Bcl-2能使細胞長期存活，抑制細胞凋亡，而其相關(guān)蛋白Bax則在功能上與之相反，會促進細胞凋亡[29-30]。Wei等[31]通過體內(nèi)和體外試驗發(fā)現(xiàn)，蕎麥根提取物對H22肝癌細胞具有顯著的抑制作用，并且能顯著改善環(huán)磷酰胺造成的肝組織損傷，其機制可能與上調(diào)Bax的表達和下調(diào)Bcl-2的表達有關(guān)。

本試驗在研究綠豆活性肽肝癌抑制作用的同時，考察了其對小鼠免疫器官、肝臟和腎臟功能的影響，并對其作用機制進行了初步探究。結(jié)果表明，陽性對照組藥物和綠豆活性肽對荷瘤小鼠腫瘤的生長均有明顯的抑制作用，綠豆活性肽高劑量組抑瘤率達32.6%；綠豆活性肽能增大小鼠免疫器官的質(zhì)量，增強小鼠的免疫功能，改善荷瘤小鼠腫瘤導(dǎo)致的肝組織損傷，而陽性對照組藥物顯著抑制了小鼠的免疫功能，且對肝臟和腎臟具有明顯的損害作用；綠豆活性肽的腫瘤抑制作用可能與抑制TE端粒酶活性、促進腫瘤細胞Bax表達、抑制Bcl-2表達有關(guān)。

肝癌是目前影響人類健康的重大疾病，由于起病隱匿、進展迅速，借助化學(xué)藥物進行化療是目前常用的治療手段之一。在臨床上，化學(xué)藥物雖然具有一定的治療效果，但對機體損害嚴重，不良反應(yīng)較大[32]。本試驗結(jié)果顯示，綠豆活性肽的腫瘤抑制作用明顯，且能顯著改善腫瘤導(dǎo)致的機體損傷，這為綠豆資源的綜合利用和將綠豆活性肽開發(fā)為保健食品及特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品提供了理論依據(jù)。