高等植物二氫黃酮醇4-還原酶基因研究進(jìn)展

于婷婷 倪秀珍 高立宏 韓國軍 朱長甫 盛彥敏

(長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,長春 130032)

高等植物呈現(xiàn)出豐富多彩的顏色依賴于天然植物色素的存在。不同植物的不同器官中存在不同含量及種類的色素，導(dǎo)致植物呈現(xiàn)出不同的顏色。除此之外，高等植物花色主要由四種色素組成，分別為葉綠素、類黃酮(flavonoids)、類胡蘿卜素(carotenoids)和甜菜色素(betalains)，不同種類的植物，積累的色素的種類也不同[1～6]。自然條件下花青素(anthocyanidins)常以其糖苷衍生物—花青素苷(anthocyanins)的形式存在的，隸屬于類黃酮，是一種水溶性天然色素，在植物中廣泛存在。類胡蘿卜素可與花青素苷或甜菜色素同時(shí)存在，但甜菜色素不與花青素苷同時(shí)存在[1～2]。植物主要的花青素有：矢車菊色素(cyanidin)、飛燕草色素(delphinidin)和天竺葵色素(pelargonidin)[7](圖1)(在B環(huán)4′上取代基是羥基者為天竺葵色素；3′和4′上取代基是羥基者為矢車菊色素；3′、4′和5′均為羥基取代的為飛燕草色素)。三種花青素由于在類黃酮骨架上的R1和R2位不同程度的羥基化和甲基化又會衍生出不同的花青素。本文概述了花青素苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和花青素苷合成相關(guān)的調(diào)控基因，重點(diǎn)結(jié)合作者的工作綜述了DFR的底物特異性以及克隆的DFR基因在植物基因工程中的應(yīng)用。

名稱NameR1R2天竺葵色素PelargonidinHH矢車菊色素CyanidinOHH飛燕草色素DelphinidinOHOH芍藥色素PeonidinOCH3H牽?；ㄉ豍etunidinOCH3OH錦葵色素MalvidinOCH3OCH3

1 花青素苷的生物合成

自20世紀(jì)80年代開始,遺傳學(xué)和分子生物學(xué)家通過對玉米(Zeamays)籽粒、金魚草(Antirrhinummajus)和矮牽牛(Petuniahybrida)以及擬南芥(Arabidopsisthaliana)等模式植物花顏色變異突變體的研究，花青素苷代謝途徑及關(guān)鍵酶類已經(jīng)較為清楚。可將與花青素苷生物合成相關(guān)的基因劃分為兩種類型，一種類型為結(jié)構(gòu)基因，為植物所共同擁有，直接編碼相關(guān)的關(guān)鍵酶類[8]；另一類則是調(diào)控基因，該類基因調(diào)控合成基因的表達(dá)強(qiáng)度以及模式，且控制時(shí)空表達(dá)的變化[8]。

1.1 花青素苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因

花青素苷的生物合成是類黃酮合成途徑中的一個(gè)分支途徑(圖2)[9～10]。查爾酮合酶(CHS)催化1個(gè)分子的p-香豆酰CoA(p-Coumaroyl-CoA)和3個(gè)分子的丙二酰CoA(Malonyl-CoA)縮合成類黃酮途徑中的第一個(gè)中間產(chǎn)物—柚皮素查爾酮(Naringenin chalcone)，它是該途徑當(dāng)中的第一個(gè)限速酶，柚皮素查爾酮為類黃酮提供了基本的碳骨架。根據(jù)類黃酮化合物結(jié)構(gòu)，將其分為黃酮(flavones)、黃烷酮(flavanones)、黃酮醇(flavonols)、黃烷-3,4-二醇(flavan-3,4-diols)(無色花青素，leucoanthocyanidin)、原花青素(縮合單寧)[proanthocyanidins(condensed tannins)]、異黃酮(isoflavonoids)和花青素苷等主要的類型[3,11～13]。在查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的催化下柚皮素查爾酮轉(zhuǎn)化為類黃酮化合物合成的直接前體—黃烷酮類的柚皮素(Naringenin)?；ㄇ嗨剀盏纳锖铣赏緩皆谌齻€(gè)羥化酶[黃烷酮3-羥化酶(F3H)、類黃酮3′-羥化酶(F3′H)和類黃酮3′,5′-羥化酶(F3′5′H)]作用下形成3個(gè)分支(圖2)。其中，F(xiàn)3′H和F3′5′H能夠決定花青素B環(huán)羥基化類型，結(jié)果將直接影響所產(chǎn)生的花青素苷的種類，克隆的F3′H和F3′5′H基因已廣泛應(yīng)用于改變植物(如康乃馨和玫瑰等)花顏色的基因工程[3]。F3H催化柚皮素C環(huán)3位加上一個(gè)羥基，生成二氫堪非醇(Dihydrokaempferol，DHK)。F3′H催化DHK的B環(huán)3′位置羥基化生成二氫櫟皮黃酮(Dihydroquercetin，DHQ)，而二氫楊梅黃酮(Dihydromvricetin，DHM)則是由F3′5′H催化DHK的B環(huán)3′和5′位置羥基化生成或者催化DHQ生成DHM。二氫黃酮醇(Dihydroflavonols)(DHK、DHQ和DHM)是花青素苷和黃酮醇合成途徑的中間產(chǎn)物(圖2)?；ㄉ男纬梢蕾囉诙潼S酮醇B環(huán)上的羥基數(shù)目，其數(shù)目越多形成的花青素的顏色越藍(lán)。藍(lán)/紫色的花往往包含基于飛燕草色素的花青素苷，洋紅色/紅色的花主要含有基于矢車菊色素的花青素苷，而橙/磚紅色的花含有基于天竺葵色素的花青素苷[3,6]。

在花青素的合成過程中，二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)是其下游途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵的酶，直接影響花色的形成。DFR在輔助因子還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的參與下，可選擇性地催化3種二氫黃酮醇(DHK、DHQ和DHM)形成相應(yīng)的不穩(wěn)定無色花青素(Leucoanthocyanidins)，包括無色飛燕草色素(Leucodelphinidin)、無色矢車菊色素(Leuc-ocyanidin)和無色天竺葵色素(Leucopelargonidin)(圖2～3)[11,14]。生成的無色花青素是花青素苷、兒茶素以及原花色素的共同前體[11～12,15]。而FLS催化3種二氫黃酮醇(DHK、DHQ和DHM)分別形成相應(yīng)的三個(gè)黃酮醇[16]：堪非醇(Kaempferol)、槲皮素(Quercetin)和楊梅素(Myricetin)。DFR和FLS競爭二氫黃酮醇作為其酶的底物(圖2)[17]?；ㄇ嗨睾厦?ANS)將三種無色二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化成花青素，它們與花色的產(chǎn)生直接相關(guān)。最后，花青素糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)，將花青素在細(xì)胞質(zhì)和液泡轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄇ嗨剀誟3,6,8]。GT影響植物花青素的穩(wěn)定性和可溶性，糖基化的位置即由它決定。

圖2 植物類黃酮代謝途徑中花青素苷合成示意圖[11] ANS.花青素合酶；CHI.查耳酮異構(gòu)酶；CHS.查耳酮合酶；DFR.二氫黃酮醇4-還原酶；F3H.黃烷酮3-羥化酶；F3′H.類黃酮3′-羥化酶；F3′5′H.類黃酮3′,5′-羥化酶；FLS.黃酮醇合酶；FSⅡ.黃酮合酶Fig.2 A schematic diagram of anthocyanin biosynthesis in plant flavonoid metabolic pathway ANS. Anthocyanidin synthase; CHI. Chalcone isomerase; CHS. Chalcone synthase; DFR. Dihydroflavonol 4-reductase; F3H. Flavanone 3-hydroxylase; F3′H. Flavonoid 3′-hydroxlase; F3′5′H. Flavonoid 3′,5′-hydroxlase; FLS. Flavonol synthase; FSⅡ. Flavone synthase

圖3 二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)的催化反應(yīng)示意圖[14] 在二氫黃酮醇的R1和R2上取代基是氫原子者為二氫堪非醇(DHK)，R1上取代基是羥基而R2上取代基是氫原子者為二氫櫟皮黃酮(DHQ)，在R1和R2上取代基都是羥基者為二氫楊梅黃酮(DHM)。在無色花青素的R1和R2上取代基是氫原子者為無色天竺葵色素，R1上取代基是羥基而R2上取代基是氫原子者為無色矢車菊色素，在R1和R2上取代基都是羥基者為無色飛燕草色素。Fig.3 A schematic diagram of reaction catalyzed by dihydroflavonol 4-reductase(DFR) In dihydroflavonol,dihydrokaempferol(DHK,R1=H,R2=H)；dihydroquercetin(DHQ,R1=OH,R2=H)；dihydromyricetin(DHM,R1=OH,R2=OH). In leucoanthocyanidins,leucopelargonidin(R1=H,R2=H); leucocyanidin(R1=OH,R2=H); leucodelphinidin(R1=OH,R2=OH).

1.2 花青素苷合成相關(guān)的調(diào)控基因

眾多結(jié)構(gòu)基因編碼的酶催化生成花青素苷，這些酶包括CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、ANS和GT等，生成的花青素苷隨后經(jīng)過各種修飾后會被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡等部位儲存起來。這些基因可被光、溫度、蔗糖、干旱、植物激素以及其它生物脅迫等調(diào)控[6,18～20]，但是花青素苷的生物合成受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，并主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。也有一些花青素苷途徑的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平上，此外植物microRNA亦參與調(diào)控花青素苷生物合成過程[18]。在花青素苷的合成途徑中，轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，通過多步調(diào)控作用來調(diào)控代謝物的含量。目前已經(jīng)鑒定了三類起調(diào)控作用的重要轉(zhuǎn)錄因子：MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40(WDR)蛋白[19～25]。在大部分的物種中，都是由MBW復(fù)合體來調(diào)控花青素苷的生物合成，該復(fù)合體由MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白構(gòu)成，該復(fù)合體結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的特定DNA序列(順式作用元件)進(jìn)行調(diào)控[19,25～29]，各類器官會差異表達(dá)這三種調(diào)控因子，通過形成MBW復(fù)合體的形式直接來調(diào)控花青素苷結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[19～25]。MBW復(fù)合體的特異性調(diào)控作用主要依賴于MYB和bHLH，它們可以結(jié)合到特異的DNA序列上，而WD40則不能直接與DNA作用。對于復(fù)合體中WD40作用的研究，目前還沒有得出明確的結(jié)論，有研究者推測WD40可能在參與信號的傳遞、復(fù)合體的穩(wěn)定或定位等方面發(fā)揮作用[19]。祝志欣和魯迎青[19]詳盡地綜述了高等植物花青素苷轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合體在調(diào)控花青素苷生物合成過程中的作用機(jī)制,我們在此文中主要綜述目前人們對植物DFR底物特異性的研究現(xiàn)狀以及克隆的DFR基因在植物基因工程中的應(yīng)用及展望。

2 DFR的底物特異性

二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)是將二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄇ嗨剀辗磻?yīng)的第1個(gè)酶，它功能的缺失將直接導(dǎo)致花青素?zé)o法形成[30]。因此，DFR是花色形成的一個(gè)重要調(diào)控點(diǎn)。在不同的物種中，DFR的氨基酸序列在很多區(qū)域上有較高的同源性，但研究發(fā)現(xiàn)不同物種的DFR對3種二氫黃酮醇底物的偏愛性存在差異，最終植物呈現(xiàn)出不同的花色。例如大花蕙蘭(Cymbidiumhybrids)和矮牽牛的DFR不能有效還原DHK，卻能有效地催化DHQ和DHM，導(dǎo)致的結(jié)果就是，花瓣中積累矢車菊色素苷和飛燕草色素苷，卻幾乎不積累天竺葵色素苷[31～34]。既使是在FLS、F3′H和F3′5′H缺失的矮牽牛中也只能在花瓣中積累極少量的天竺葵色素苷。非洲菊(Gerberahybrida)DFR能夠催化3種二氫黃酮醇，這種對底物的選擇性機(jī)制解釋了為什么矮牽牛中會缺少橙色的天竺葵色素[16,31～32]。關(guān)于DFR底物特異性的分子機(jī)理，Beld等根據(jù)比對玉米、矮牽牛和金魚草DFR氨基酸序列，推測在DFR中一段13個(gè)氨基酸的區(qū)域可能負(fù)責(zé)DFR底物特異性，但沒有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)這一推測[35]。后來，Johnson等發(fā)現(xiàn)在非洲菊DFR(GhDFR)中一個(gè)氨基酸的替換[第134位天冬酰胺(N)替換為非極性亮氨酸(L)的N134L突變型DFR]可以改變DFR底物特異性[32]。第134位天冬酰胺(N)位于一個(gè)由26個(gè)氨基酸構(gòu)成的底物特異性區(qū)域[包含Beld等預(yù)測的13個(gè)氨基酸區(qū)域][32,35]。底物特異結(jié)合區(qū)內(nèi)的氨基酸排列順序決定了DFR對不同底物結(jié)合的特異性，在不同物種中這個(gè)氨基酸的序列也是高度保守的。大多數(shù)物種在DFR134位(對應(yīng)于非洲菊DFR的氨基酸序列)是天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)，在145位大多是谷氨酸(E)[32～33]。一些雙子葉植物(非洲菊、玫瑰、金魚草和康乃馨)和單子葉玉米能夠以DHK為底物的，其DFR在134位和145位分別是天冬酰胺(N)和谷氨酸(E)，而矮牽牛DFR在134位和145位分別是天冬氨酸(D)和谷氨酰胺(Q)[32]。Johnson等發(fā)現(xiàn)該底物特異選擇結(jié)構(gòu)域內(nèi)的單個(gè)氨基酸的改變就能改變DFR底物特異性，在矮牽牛中，因?yàn)樵诘孜锾禺愡x擇結(jié)構(gòu)域的134位是D，矮牽牛的DFR(PhDFR)就不能催化DHK生成天竺葵色素，而其它很多DFR第134位是N的則可以以DHK為底物[32]，但作者未闡述將矮牽牛DFR134位的D替換為N對底物選擇的影響。

將非洲菊DFR第134位天冬酰胺(N)替換為非極性亮氨酸(L)，在轉(zhuǎn)基因矮牽牛中，非洲菊N134L突變型DFR優(yōu)先轉(zhuǎn)化DHK而不是DHQ和DHM，這就表明非洲菊DFR第134位天冬酰胺(N)在底物特異性中起著重要的作用[32]。將非洲菊DFR第145位谷氨酸(E)替換為亮氨酸(L)，E145L突變型DFR不能還原底物DHK[32]。因此，非洲菊DFR第134位和145位氨基酸(底物特異選擇結(jié)構(gòu)域)可直接影響底物特異性[32]。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtDFR2在相應(yīng)的134位是天冬氨酸(D)，體外酶學(xué)分析表明能轉(zhuǎn)化DHK，而MtDFR1在該位置是天冬酰胺(N)，轉(zhuǎn)化DHK的效率大大提高(MtDFR1對DHK的催化活性約為MtDFR2的2.5倍)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該位置是N或D直接決定DFR是否能夠轉(zhuǎn)化DHK以及轉(zhuǎn)化效率的強(qiáng)弱[36]。二者對DHM的催化活性都很低，對DHQ的催化活性接近，表明可能還有其它的底物結(jié)合位點(diǎn)影響MtDFR對底物的選擇[36]。葡萄(Vitisvinifera)DFR的三維結(jié)構(gòu)解析證實(shí)了由這26個(gè)氨基酸構(gòu)成的底物特異性結(jié)合區(qū)的重要性[14]，其中有一個(gè)特殊的133氨基酸位點(diǎn)(對應(yīng)于非洲菊DFR的134位氨基酸)負(fù)責(zé)底物識別，但是它不能單獨(dú)識別二氫黃酮醇B環(huán)羥基化[14]。草莓(Fragagariaxananasacv.elsanta)的DFR2蛋白133位氨基酸(對應(yīng)于非洲菊DFR134位氨基酸)是天冬酰胺(N)，而DFR1在此相應(yīng)位是丙氨酸(A)[37]。體外酶學(xué)分析表明，草莓DFR1傾向于以DHK為底物，而DFR2可分別轉(zhuǎn)換DHQ和DHM為無色矢車菊色素和無色飛燕草色素，但不能以DHK作為底物[37]。草莓DFR1蛋白133位氨基酸為非極性氨基酸(A)，這與Johnson等發(fā)現(xiàn)的非洲菊N134L突變型DFR的結(jié)果是相同的[32]。但觀察到的草莓DFR2底物特異性(草莓DFR2可還原DHQ和DHM，但不能以DHK作為底物)不能由野生型非洲菊GhDFR(GhDFR可還原DHK、DHQ和DHM三種二氫黃酮醇，是非特異性的DFR)134位是N(天冬酰胺)的存在所解釋[32,37]。綜上所述，植物DFR底物特異性并不都是僅僅由相應(yīng)于非洲菊DFR第134位氨基酸所決定的。僅僅基于DFR氨基酸序列的功能推測可能是不適當(dāng)?shù)?，而通過對大腸桿菌或酵母中表達(dá)的DFR基因產(chǎn)物進(jìn)行的功能分析，尤其是在過量表達(dá)DFR基因的轉(zhuǎn)基因植物中的功能分析對于鑒定DFR的功能以及DFR底物特異性是必需的。

3 DFR基因在植物基因工程中的應(yīng)用

自然界存在一些重要花卉但色彩不全，如矮牽牛、大花蕙蘭和鳶尾(Irisspp.)缺少橙色花，而菊花(Chrysanthemummorifolium)、玫瑰(Rosahybrida)和康乃馨(Dianthuscaryophyllus)缺少紫色和藍(lán)色花[2～3,6,31～32,38]，這些是用傳統(tǒng)雜交育種方法無法解決的問題。在合成花青素苷的過程中，存在不同的酶競爭相同的底物(如FLS、F3′H、F3′5′H和DFR競爭底物DHK)以及同一個(gè)酶(如FLS、F3′H和DFR)催化不同的底物的情況(圖2)，在轉(zhuǎn)基因植物中異源表達(dá)的DFR要與內(nèi)源FLS、F3′H和F3′5′H競爭DHK，這也是影響最終花青素合成的要素。FLS和3個(gè)羥化酶活性的有無、強(qiáng)弱以及DFR的底物特異性選擇是決定最終合成的花青素苷的種類和花色的主要因素[3,11,38～41]。目前，通過克隆DFR基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)手段可以改變轉(zhuǎn)基因植株的花色(表1)。

Hayashi等研究發(fā)現(xiàn)，DFR除了可以調(diào)節(jié)花色外，當(dāng)增強(qiáng)其活性時(shí)，還可提高轉(zhuǎn)基因水稻對氧化和細(xì)菌性病害引起的細(xì)胞死亡的耐受力[53]。煙草中過量表達(dá)茶樹(Camelliasinensis)DFR基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草的類黃酮含量和抗氧化能力[54]。因此，應(yīng)用DFR基因的基因工程對于改變植物花顏色和提高植物抗性和抗氧化物質(zhì)等具有重要意義。

4 研究展望

雖然已克隆出多種植物的DFR基因并利用其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化來改變轉(zhuǎn)基因植物的花色，但決定DFR底物特異性的分子機(jī)制目前仍不十分清楚，克隆的編碼具有DHK底物特異性的DFR基因也不多。最近的研究表明，鳶尾科的香雪蘭(Freesiahybrida)中有8個(gè)編碼DFR類似蛋白組成的基因簇。對其中的三個(gè)FhDFR基因通過對大腸桿菌中表達(dá)的DFR基因產(chǎn)物進(jìn)行的功能分析以及應(yīng)用擬南芥dfr(tt3-1)突變體的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)hDFR1,FhDFR2和FhDFR3能夠利用DHM生成無色飛燕草色素，而FhDFR2還可以將DHQ轉(zhuǎn)化為無色矢車菊色素，但FhDFR1,FhDFR2和FhDFR3不能以DHK作為底物[55]。FhDFR的這一底物特異性與香雪蘭花瓣中積累的花青素苷種類(主要含有飛燕草色素苷和矢車菊色素苷，但不含有天竺葵色素衍生來的天竺葵色素苷)一致。我們課題組對橙花龍膽(GentianaluteaL. var.aurantiaca)花瓣的類黃酮組份分析研究表明，橙花龍膽橙色花瓣中只含有天竺葵色素苷，而不含有矢車菊色素苷和飛燕草色素苷[8]。因此，我們推測從橙花龍膽花瓣中克隆的DFR基因編碼的DFR可能具有DHK底物特異性。目前許多改變植物花顏色的基因工程都應(yīng)用FLS、F3′H和F3′5′H基因功能缺失突變體[30,42～43]作為轉(zhuǎn)基因受體或應(yīng)用多基因轉(zhuǎn)化[39,44～45,48]技術(shù)在表達(dá)具有底物特異性的DFR基因的同時(shí)抑制內(nèi)源FLS、F3′H和F3′5′H基因的表達(dá)。然而，許多重要園藝植物很難獲得像模式植物矮牽牛那樣的FLS、F3′H和F3′5′H基因功能缺失突變體，因此，克隆具有不同底物特異性的DFR基因，尤其是克隆到具有DHK底物特異性的DFR基因在改變植物花顏色的基因工程中具有重要的意義。隨著研究的日漸深入，克隆的編碼具有不同底物特異性的DFR基因?qū)⒅饾u增多，這將有助于揭示DFR底物特異性的分子機(jī)制以及拓寬應(yīng)用DFR基因在植物基因工程中的應(yīng)用。

表1 應(yīng)用二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因遺傳轉(zhuǎn)化獲得的改變植物花顏色的植物物種Table 1 List of plant varieties with flower modification created by expression of dihydroflavonol 4-reductase(DFR) genes