黑木耳菌種及培養(yǎng)基的篩選

陳方昕，李文光，馬小麗，曲永艷(.哈爾濱市林業(yè)科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 5009；.哈爾濱市林業(yè)局基金站，黑龍江 哈爾濱 5008；.哈爾濱市林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院有限公司，黑龍江 哈爾濱 50000)

黑木耳〔Auriculariaauricula(L.ex Hook.)Underw〕，別名光木耳、樹耳[1]。隸屬于真菌界(Fungi)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、傘菌亞門(Agaricomycotina)、傘菌綱(Agaricomycetes)、木耳目(Auriculariales)、木耳科(Auriculariales)、木耳屬(Auricularia)，是我國傳統(tǒng)的食用菌[2]。

黑木耳是一種大型真菌，其菌絲體由多具橫隔和分支的管狀菌絲組成[3]。子實(shí)體由朽木內(nèi)的菌絲體發(fā)育而來，初期為半透明的黑灰色圓錐形，后呈杯狀，最后變?yōu)槿~狀或耳狀，基部狹細(xì)，近無柄，耳片直徑多為4～12 cm，厚度0.8～1.2 mm，其膠質(zhì)富有彈性，經(jīng)干燥后的黑木耳會明顯收縮，質(zhì)地變得硬而脆[4]。黑木耳子實(shí)體多為深褐色或黑色，呈背凸腹凹狀，其背面有柔軟而細(xì)小的短絨毛，腹部表面多呈平滑狀，有些帶有脈絡(luò)狀褶皺[5]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

地栽黑木耳有很多優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種，本研究主要選用了黑29、延明1號、黑916、延農(nóng)11、長白山7號等作為試驗(yàn)用菌種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母種篩選

(1)培養(yǎng)基制作。稱量去皮后的馬鈴薯塊200 g，沸水煮30 min后過6層紗布得到土豆液。在1 000 mL土豆液種加入瓊脂20 g、蛋白胨10 g，加熱至完全溶化后分裝成4瓶，121 ℃高壓條件下滅菌20 min。

(2)菌種轉(zhuǎn)接。將滅菌后的培養(yǎng)基在超凈工作臺中分裝制成PDA平面培養(yǎng)基，每培養(yǎng)皿含45 mL培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿底部畫好十字線滅、烘干備用。待上述培養(yǎng)基冷卻凝固后，將上述7個不同菌種接到培養(yǎng)底部劃好的十字架交點(diǎn)處，菌種直徑為3 mm，每個菌種接種3個平板。

(3)菌落生長速度測定。將接種后的培養(yǎng)皿放入25 ℃的黑暗條件下倒置培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)后每隔一天定時對菌落直徑測定，記錄結(jié)果，并依據(jù)以下公式計(jì)算菌落生長速度。

菌落生長速度=(菌落直徑平均值—接種菌柄直徑)/培養(yǎng)天數(shù)

(4)菌絲生長勢評價(jià)。根據(jù)菌落顏色、粗壯程度、濃密等指標(biāo)來衡量。

1.2.2 母種培養(yǎng)基確定 將上述篩選出的黑木耳優(yōu)質(zhì)菌株接種到不同配方的培養(yǎng)基中，而后將培養(yǎng)皿置于25 ℃條件下進(jìn)行黑暗恒溫培養(yǎng)。期間每天定時觀察記錄其菌絲的生長密度、色澤及菌絲長勢，同時待菌絲長滿后每隔一天對菌直徑進(jìn)行測定記錄，最后通過菌絲的生長速度及菌絲生長密度、菌絲生長勢等指標(biāo)篩選出最適的母種培養(yǎng)基配方。

①：馬鈴薯200g + 葡萄糖 20 g；

②：①+ 蛋白胨 3 g；

③：② + 酵母膏 2 g；

④：①+ KH2PO43 g、MgSO40.5 g；

Sephadex G-75 凝膠柱分離純化：洗脫液為Tris-HCl，洗脫速度為 0.1 mL/min，上樣量為20 mL，在280 nm下收集各峰，檢測活性，收集活性最高的組分于冰箱冷凍保存。

⑤：④+ VB110 mg；

以上各配方均含有瓊脂 20 g、水 1 000 mL。

1.2.3 原種培養(yǎng)基篩選 將木屑、麥麩、米糠、蔗糖、石灰，石膏等按不同比例配制，分別裝于250 mL 三角瓶中至滿刻度，盡量使每瓶料質(zhì)量及松緊度一致，將其表面壓平，紗布棉花塞口后牛皮紙覆包，濕熱滅菌(121 ℃，70 min)后冷卻至室溫，在超凈臺內(nèi)接種，每瓶料面中央接等量一級菌種， 25 ℃暗培養(yǎng)，期間注意通風(fēng)。定期觀察各配方菌種萌發(fā)情況、菌絲長勢及滿瓶時間等。每個配方設(shè)5個重復(fù)。配方如下：

A:木屑78%、麥麩20%、石灰1%、石膏1%；

B:木屑78%、麥麩20%、蔗糖1%、石灰0.5%、石膏0.5%；

C:木屑78%、米糠21%、石灰0.5%、石膏0.5%；

D:木屑78%、米糠21%、蔗糖0.5%、石膏0.5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 母種的篩選

表1 不同菌種在PDA培養(yǎng)基中的生長速度

表2 不同菌種在PDA培養(yǎng)基中的生長速度方差分析結(jié)果

表3 不同菌種的菌絲生長情況

2.2 母種培養(yǎng)基篩選

表4至表6顯示：延明1號的菌絲長勢在配方⑤號培養(yǎng)基中生長狀況最好，菌絲潔白，菌落豐厚且邊緣整齊；其次是配方③和④；從密度和長勢衡量，①號配方較③號和④號略次；配方②生長狀況最差，菌絲灰白，菌絲長勢較弱。從菌絲生長速度看，配方⑤菌絲生長速度最快，為4.71 mmd-1且與其他各組間差異顯著；配方④菌絲生長速度次之；配方①和配方③菌絲生長速度較慢，且組間差異不顯著；配方②生長速度最慢。綜合考慮，配方⑤為最佳母種培養(yǎng)基，配方④次之，因此在生產(chǎn)中應(yīng)采用配方④和配方⑤。

表4 不同培養(yǎng)基菌絲生長狀況

表5 黑木耳延明1號菌種在不同培養(yǎng)基生長速度

表6 黑木耳延明1號菌種在不同培養(yǎng)基生長速度方差分析結(jié)果

2.3 原種制作

2.3.1 不同原種培養(yǎng)基配方

表7 各配方滿瓶時間及菌絲狀態(tài)

由表7可知，上述4種原種培養(yǎng)基配方中，配方D菌絲滿瓶時間最快為20 d，菌絲密度較密，菌絲生長勢粗壯，色澤為淡白色；配方B菌絲滿瓶時間較配方D稍慢為22 d，但其菌絲密度很密，生長粗壯，色澤為潔白色；配方A和配方C菌絲生長滿瓶時間很慢，且菌絲密度稀疏，菌絲生長勢較弱，色澤為灰白色和淡白色。綜合考慮，配方B為最佳母種培養(yǎng)基，配方D次之，因此在生產(chǎn)中應(yīng)采用配方B和配方D。

2.3.2 原種制作技術(shù)

二級菌種制作過程：配料—裝瓶—塞棉塞—裝筐—滅菌—冷卻到30 ℃。

在經(jīng)消毒的接種室內(nèi)進(jìn)行接種，兩個人操作：一人持拔開棉塞的原種瓶，另一人用接種針在母種試管斜面取約1.5 cm2的菌絲塊迅速移入原種瓶中，棉塞經(jīng)火焰消毒后塞上。每支菌種可擴(kuò)繁8瓶二級菌種，接種完成后可放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，前7～10 d溫度控制在25～28 ℃，之后溫度保持在25 ℃。

3 結(jié)論

本論文通過對黑木耳菌種和培養(yǎng)基的篩選、栽培條件的試驗(yàn)系統(tǒng)地對黑木耳產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究，主要結(jié)果如下：

3.1 通過對7種黑木耳菌種的栽培試驗(yàn)，篩選出了優(yōu)良的黑木耳栽培菌種，得出延明1號，延明11號和蛟耳329可以作為黑木耳產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)菌種；通過母種培養(yǎng)基試驗(yàn)，篩選出了黑木耳最適的培養(yǎng)基配方：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、VB110 mg、瓊脂 20 g、水1 000 mL。

3.2 通過對不同原種培養(yǎng)基的配方篩選試驗(yàn)，得出最佳培養(yǎng)基配方為配方B: 木屑78%、麥麩20%、蔗糖1%、石灰0.5%、石膏0.5%。其次為配方D：木屑78%、米糠21%、蔗糖0.5%、石膏0.5%。

3.3 通過對不同栽培種培養(yǎng)基的配方篩選試驗(yàn)，根據(jù)黑木耳栽培產(chǎn)量和品質(zhì)，得出最佳培養(yǎng)料配方：鋸末86.5%、麥麩10%、豆餅粉2%、生石灰0.5%、石膏粉1%。