QuEChERS-氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜法測定茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸殘留

羅彤，付文雯，郭盧云，王會霞，*

（1.湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢430070；2.湖北輕工職業(yè)技術學院，湖北武漢430070）

草甘膦（glyphosate，Gly），屬于廣譜、非選擇性、滅生性除草劑，由于其具有低廉的價格和優(yōu)良的除草性能，廣泛的應用于橡膠、果園、茶園等少、免耕田除草以及高稈作物田行間定向保護性噴霧除草[1]。草甘膦在環(huán)境和生物體中富集并通過食品進入人體，會對人體健康造成危害。近年來，茶葉中草甘膦及其主要代謝產物氨甲基膦酸殘留量超標的問題時有發(fā)生，這已經影響到消費者的食用安全及茶葉的出口貿易。因此建立一種簡便、快捷、有效的草甘膦殘留的檢測方法具有重要的意義。

草甘膦和氨甲基膦酸都極易溶于水，難溶于有機試劑，揮發(fā)性低，難以氣化，缺少生色基團，難以直接利用常規(guī)方法進行檢測[2]。目前，草甘膦的測定常涉及一些特殊的技術手段，如柱前或柱后衍生化處理[2-5]、采用離子交換色譜[6]等進行分析。我國現(xiàn)有的國標方法[7]和行業(yè)標準[8]中，前處理采用固相萃取小柱凈化，洗脫液中水含量高，濃縮時間長，費時費力。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe） 技術是一種快速、簡單、廉價、高效的樣品前處理方法，主要通過非極性相互作用、極性相互作用、離子相互作用等選擇性保留基質干擾成分，進而達到凈化的效果。QuECh－ERS可以根據(jù)不同樣品基質以及不同目標物的理化特性差異，并且通過調整提取溶劑、吸附劑等來改進QuEChERS前處理技術，讓其應用于更加廣泛的領域，但QuEChERS在茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸的檢測應用報道較少，曹慧等[9]建立了QuEChERS前處理和液質質相結合快速測定了茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸含量的方法。國標中的氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 能夠對目標化合物進行確證，但是單離子監(jiān)測（Single ion monitoring，SIM）模式采集的質譜信息較少，選擇性差，易受基質干擾，在定性方面存在不足，容易造成假陽性結果，而氣相色譜-串聯(lián)質譜法（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS） 采用選擇反應監(jiān)測（Selective reaction monitoring，SRM）數(shù)據(jù)采集模式，可以有效排除基質干擾，使定性定量結果更加可靠[10]。因此本研究擬采用柱前三氟乙酸酐-七氟丁醇衍生和改進的QuEChERS前處理方法，通過GC-MS/MS分析樣品，確定柱前衍生-QuEChERS-氣相色譜串聯(lián)質譜法檢測茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸殘留的方法，為實現(xiàn)茶葉中有草甘膦和氨甲基膦酸殘留的快速監(jiān)測提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TSQ 8000evo氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；XS204分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Allegra 6412冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司；MDF-U54V-PC立式超低溫冰箱：日本三洋電器集團；WNE 29水浴振蕩器：德國美墨爾特有限公司；Mill-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司；XH-C渦旋混合器：江蘇金怡儀器科技公司；2600T超聲波清洗器：上海安譜科學儀器有限公司。

草甘膦（純度≥99.0%）、氨甲基膦酸（純度≥99.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；三氟乙酸酐、七氟丁醇（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯（色譜純）：德國Merck公司；檸檬醛（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳（graphitized carnon black，GCB）、C18：博納艾杰爾科技有限公司；綠茶、紅茶、烏龍茶樣品為實驗室送檢樣品。

1.2 標準溶液和衍生劑的配制

稱取草甘膦和氨甲基膦酸標準品各0.05 g，用水溶解并定容至50 mL塑料容量瓶，配制成1 000 mg/L標準溶液，4℃下保存待用。

草甘膦和氨甲基膦酸標準使用溶液：將標準工作溶液用超純水逐級稀釋成濃度為 5、10、25、50、100、250、500 μg/L 標準使用溶液。

衍生劑：三氟乙酸酐-七氟丁醇溶液，將三氟乙酸酐和七氟丁醇溶液2∶1的體積比混合，臨配臨用，并于-80℃冰箱保存。

1.3 樣品前處理

試樣制備：選取茶葉樣品，用四分法縮減取200 g，粉碎后過1.0 mm孔徑篩，混勻備用。

準確稱取1 g（精確至0.001 g），置于聚乙烯塑料離心管中，加入25 mL水，渦旋30 s，超聲20 min，于3 500 r/min離心10 min。取上清液15 mL至離心管加入15 mL二氯甲烷振蕩2 min，于3 500 r/min離心5 min。取上清液待衍生。

取1.6 mL衍生劑于衍生瓶中，加蓋后放入-80℃超低溫冰箱冷凍0.5 h后取出，用移液槍在衍生劑液面下加入50 μL提取上清液，加蓋混勻后90℃衍生1 h。取出冷卻至室溫，用氮氣吹干，并繼續(xù)氮吹0.5 h，加入2 mL 0.2%檸檬醛乙酸乙酯溶液溶解殘渣，待凈化。

取2 mL衍生液，加50 mg PSA粉末，25 mg C18粉末，25 mg GCB粉末，渦旋30 s，靜置至上層液體無渾濁物；取上層液體過0.22 μm濾膜后上機測定。

標準品按照上述方法衍生后，加入2 mL 0.2%檸檬醛乙酸乙酯溶液溶解殘渣過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.4 氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：TG-1701MS毛細管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：80℃保持 1.5 min，以 30℃/min升溫至270℃，保持5 min；進樣口溫度200℃；流速：1.0 mL/min；進樣體積2 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.4.2 質譜條件

電子轟擊（electron Ionization，EI）離子源；電離能量70 eV，離子源溫度為280℃，傳輸線溫度為270℃，溶劑延遲時間為3.5 min，掃描模式為選擇反應監(jiān)測（selective reaction monitoring，SRM），優(yōu)化后的保留時間、定性和定量離子對及其碰撞能量信息見表1。

表1 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物質譜條件參數(shù)Table1 MS conditions for derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

圖1 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物在選擇反應監(jiān)測模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）in selected reaction monitoring（SRM）mode

2 結果及討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本文采用GC-MS/MS進行檢測，使用單針進樣分析目標化合物的混合標準衍生液，對草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物進行質譜全掃描分析，參考相關文獻資料[7]，確定草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物的保留時間?；衔镞M入一級質譜后，確定母離子，母離子進入二級質譜，對化合物的碰撞能量進行優(yōu)化。通過Auto SRM軟件，對化合物母離子逐步施加一定步長碰撞能量，目標化合物發(fā)生斷裂或重排，產生不同離子碎片，每個目標化合物選取兩對最具特征且響應最高的子離子，最終確定出定性離子對、定量離子對和各個物質的質譜采集參數(shù)。SRM模式能夠最大限度地消除基質干擾，而且針對化合物掃描時間窗口的設置，提高了靈敏度。草甘膦和氨甲基膦酸的衍生物在SRM模式下的總離子流圖如圖1所示。

由圖1可知，氨甲基膦酸衍生物保留時間為5.93 min；草甘膦衍生物保留時間為6.13 min。

2.3 QuEChERS方法的優(yōu)化

2.3.1 凈化方式的選擇

分散固相萃取常用的凈化劑有PSA、石墨化炭黑（GCB）和C18等。PSA可吸附糖、有機酸、脂肪酸等極性干擾物；C18可吸附脂肪等非極性干擾物；GCB可吸附色素、甾醇等大分子非極性干擾物[11]。本試驗首先分別選用PSA、C18和GCB對加標茶葉樣品提取液進行凈化，試驗結果表明：PSA和GCB對草甘膦和氨甲基磷酸具有較強的吸附性，目標化合物的回收率都低于10%，原因是PSA對分子結構中帶有羧基的化合物有一定的保留作用[12]；GCB表面是正六元環(huán)結構，對平面分子有極強的親和力[13]，因此會吸附平面結構的農藥，導致回收率低，而C18在水提取液中容易結塊，凈化效果不佳。因此，QuEChERS法不適用于草甘膦和氨甲基膦酸提取液的直接凈化處理。

草甘膦和氨甲基膦酸用三氟乙酸酐和七氟丁醇衍生劑衍生后，氨基基團被衍生為相應的三氟乙酰衍生物，羧基和膦酸基團被衍生形成相應的七氟丁酯。因此，本試驗擬先用衍生劑將草甘膦和氨甲基膦酸衍生，然后采用QuEChERS前處理法凈化衍生液，降低對離子源的污染，提高靈敏度。本試驗以50 μg/L加標水平的茶葉為考察對象，提取液衍生后進行凈化處理，并以PSA、GCB、C18的用量為考察因素對凈化條件進行優(yōu)化。

2.3.1.1 凈化劑的用量

考察加入的PSA用量對凈化效果的影響，試驗結果見圖2。

圖2 2 mL加標提取液中PSA用量對草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物回收率的影響Fig.2 Effect of the amount of PSA added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在2 mL加標基質衍生液中分別加入20、50、100、150、200 mg PSA。PSA具有弱陰離子交換（水溶性基質）、極性（非極性有機基質）螯合作用，可有效去除樣品中的有機酸、脂肪酸和糖等干擾物。草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的回收率隨著PSA用量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的狀態(tài)，并在PSA為50 mg時達到最大值。PSA材料的硅膠表面鍵合有極性功能團，能吸附極性化合物，而草甘膦和氨甲基膦酸是屬于極性較強的化合物，PSA用量過大，吸附完雜質，過多的PSA會對目標化合物產生吸附，因此，最終選用PSA用量為50 mg。

固定PSA用量為50 mg，考察加入的C18用量對凈化效果的影響，試驗結果見圖3。

圖3 2 mL加標提取液中C18用量對草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物回收率的影響Fig.3 Effect of the amount of C18 added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在2 mL加標基質衍生液中分別加入10、25、50、75、100 mg C18。C18吸附劑對極性較弱的脂肪酸、烯烴類及甾醇類、色素等大分子基質干擾物有較好的吸附效果。試驗發(fā)現(xiàn)，隨著C18用量的增加，草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的回收率變化不大，綜合回收率和經濟因素，我們最終選用C18為25 mg。

固定 PSA（50 mg）、C18（25 mg）用量，考察 GCB 用量對凈化效果的影響，試驗結果見圖4。

圖4 2 mL加標提取液中GCB用量對草甘膦和氨甲基膦酸衍生物回收率的影響Fig.4 Effect of the amount of GCB added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在 2 mL 衍生液中分別加入 10、25、50、75、100 mg GCB。GCB能去除部分色素、類胡蘿卜素、固醇和具有平面結構等極性大的基質干擾物，過多的GCB會對目標化合物產生吸附，因此，最終選用GCB用量為25 mg。

綜合各種因素，在2 mL衍生液中加入50 mg PSA、25 mg C18、25 mg GCB組合凈化劑較好。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

以一系列質量濃度（5 μg/L～500 μg/L）的標準溶液，在確定的色譜和質譜條件下進行測定。以峰面積為縱坐標、質量濃度（單位μg/L）為橫坐標繪制標準曲線。以3倍信噪比計算檢出限（LOD），以10倍信噪比計算定量限（LQD）。草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

試驗結果表明，草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的標準曲線的線性關系良好，相關系數(shù)（r2）均大于0.999 0。草甘膦和氨甲基膦酸的檢出限分別是0.01 mg/kg和0.005 mg/kg；定量限分別是0.03 mg/kg和0.015 mg/kg。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的線性方程、相關系數(shù)、方法檢出限和方法定量限Table2 Linear equations，correlation coefficients，LOD，and LQD of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

2.5 方法的準確度和精密度

為了驗證QuEChERS前處理方法聯(lián)合GC-MS/MS測定茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸的可行性和準確性，試驗采用不同空白茶葉基質樣品（綠茶、紅茶、烏龍茶）進行加標回收率驗證，加標水平分別為0.50、1.00、2.50 mg/kg，按照前述方法處理平行測定6次，回收率和精密度見表3。

試驗結果表明，不同茶葉基質中草甘膦和氨甲基膦酸的方法回收率分別為86.1%～101.2%和83.6%～103.4%，相對標準偏差分別為3.2%～6.7%和3.6%～7.3%，低于10%。圖5為0.50 mg/kg加標綠茶樣品的二級總離子色譜圖。

圖5 0.50 mg/kg加標綠茶樣品溶液中草甘膦和氨甲基膦酸衍生化合物的定量離子色譜圖Fig.5 Quantitative ion chromatograms of derived compounds in 0.50 mg/kg spiked concentration levels of green tea

3 結論

本試驗通過對前處理方式、凈化劑用量的優(yōu)化，建立了茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留量的柱前衍生-QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質譜法分析方法。該方法簡單、快速、基質干擾小、靈敏度高、重復性好，適用于茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留量的定量檢測，可為茶葉的安全監(jiān)管及質量控制提供技術支持。