毛細管柱氣相色譜法對果蔬汁和調(diào)味料中脫氫乙酸及4種對羥基苯甲酸酯的測定

林澤鵬，林晨，王李平，方麗，張方圓，李雪瑩，湯遜尤，潘云山

（中國廣州分析測試中心，廣東省分析測試技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070）

食品安全一直是國家關(guān)注問題的焦點之一，在一系列的食品當(dāng)中添加少量的防腐劑可以起到延長食物保質(zhì)期的作用，而添加過量的防腐劑則會威脅到人類的身體健康。本文研究對象為果蔬汁及調(diào)味料中兩類防腐劑的測定，即脫氫乙酸和4種對羥基苯甲酸酯（對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯）。脫氫乙酸別名二乙酰基乙酰乙酸，是一種低毒高效的防腐劑、防霉劑，防腐效果是苯甲酸鈉的2～10倍，在酸堿條件下均有一定的抗菌作用，尤其對霉菌的抑制作用最強[1]。脫氫乙酸是能夠迅速被人體所吸收，進入人體后即分散于血漿和許多器官中，有抑制體內(nèi)多種氧化酶的作用[2]。對羥基苯甲酸酯俗稱尼泊金酯，包括有甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等，是一類高效防腐劑，對霉菌、酵母及細菌有廣泛的抗菌作用[3]。它的優(yōu)勢在于成本低，毒性小及適用范圍廣[4]。由此可見脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯類在食品中應(yīng)用范圍特別廣，是人們每天都接觸到的其中一類食品為調(diào)味料和生活中常飲用的果蔬汁飲料等，在國家發(fā)布最新版食品安全國家標準GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中果蔬汁、復(fù)合調(diào)味料，對羥基苯甲酸酯和脫氫乙酸使用量分別不得超過0.3 g/kg和0.5 g/kg，而對羥基苯甲酸酯（以對羥基苯甲酸計）果蔬汁及部分調(diào)味料使用量不得超過0.25 g/kg。

據(jù)文獻報道，目前能夠檢測脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯的方法眾多，比如我國現(xiàn)行國家標準和行業(yè)標準氣相色譜法、高效液相色譜、高效液相色譜質(zhì)聯(lián)/質(zhì)聯(lián)法等[5-9]，這幾種標準均存在前處理方面操作繁瑣、消耗溶劑多、成本高，不利于環(huán)保，從色譜條件大多進樣時間較長，效率低，不適于做批量樣品的檢測。其他的毛細管柱氣相色譜法和快速測定法[10-14]以及液相色譜法[15-18]，這些方法大多能準確定性定量，但是快速檢測法檢出限較高，很難達到微量檢測的要求，有些方法只能檢測的樣品種類比較單一，甚至只能檢測高含量的樣品，大部分檢測方法樣品范圍較小，且不能同時測定脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯。所以很有必要建立了一種快速、高效、準確、成本低且可以同時測定果蔬汁和調(diào)味料中脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

7890A氣相色譜儀配氫火焰離子化檢測器：美國安捷倫儀器有限公司；XW-80A微型渦旋混合儀、超聲清洗儀：上海瀘西分析儀器有限公司；TDZ5-WS離心機：湖南塞特湘儀科技有限公司；N-EVAP氮吹儀：美國Organomation。

1.1.2 標準物質(zhì)及試劑

脫氫乙酸（2 mg）：中國計量科學(xué)研究院；對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯（2 mg）：Dr.Ehrenstorfer；乙酸乙酯、鹽酸、乙醇、正己烷：廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.3 標準溶液的配制

分別把脫氫乙酸、4種對羥基苯甲酸酯用乙醇配制成濃度為1 000 μg/mL的混標儲備液。

1.2 方法

稱取5 g樣品（精確至0.000 1 g）置于50 mL離心試管中，含油樣品先用正己烷30 mL除油兩次（除油過程乳化時需離心），加入體積比1∶1鹽酸0.50、10 mL乙酸乙酯，在微型漩渦混合儀振蕩2 min，靜置15 min，放于離心機離心。重復(fù)兩次合并提取液，在45℃氮吹儀濃縮至5 mL，供氣相色譜分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：DB-1701（30 m×320 mm×0.25 μm）；柱溫150℃，以10℃/min升至240℃保持4 min；進樣口220℃；采用不分流模式進樣，進樣量1 μL；FID檢測器，270℃；載氣為氮氣，流量2 mL/min；氫氣流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min；尾吹氣流量：45 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

能夠提取脫氫乙酸以及對羥基苯甲酸酯的溶劑有多種，以乙醚、丙酮、乙腈、乙醇、乙酸乙酯提取脫氫乙酸的回收率見圖1。

圖1 溶劑的回收率Fig.1 Recovery of solvents

由圖1可知，乙醚、丙酮沸點較低易揮發(fā)，導(dǎo)致回收率不高，乙醇和水不易分離，乙腈和乙酸乙酯提取回收率差異不顯著，但是乙腈的沸點較高，濃縮耗時長，所以選用乙酸乙酯作為本試驗方法的提取溶劑。

2.2 色譜柱分離效果及測定結(jié)果

按照1.2方法處理，分別抽查了9種果蔬汁和16種調(diào)味料進行檢測分析，分析結(jié)果如表1，標準圖譜和部分陽性樣品及空白圖譜見圖2。

圖2 5種標準物質(zhì)混合溶液，陽性樣品及空白樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of five standard materials mixed solution，positive sample and blank sample

在1.3的色譜條件下，采用毛細管柱DB-1701及FID檢測器測定后，清晰的可以看到脫氫乙酸和4種對羥基苯甲酸酯很好的分離開，出峰順序良好，彼此之間無干擾，達到良好的分離效果，每個樣分析時間在10 min內(nèi)就完全出峰，總時間為14 min走完。由圖2幾種目標物出峰順序和分離效果可看出，使用本方法的色譜條件明顯優(yōu)于國家標準色譜條件，彼此之間無干擾且分析時間短，作為批量檢測節(jié)省大量時間。圖中出現(xiàn)基線不夠平穩(wěn)是因為不同樣品中可能存在多種不同的干擾成分，基質(zhì)樣品本身帶有少量油脂影響及后序升溫過快導(dǎo)致，可以按照本文的除油方法進行去除，達到最佳效果，但升溫程序完全不影響目標峰，可以忽略。

2.3 標準曲線、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限

1.1.3 混合標準溶液稀釋成濃度同為：10、20、50、100、200 μg/mL的線性混合標準溶液，進樣分析。以色譜峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進行回歸分析，計算得到相應(yīng)的回歸方程，以3倍信噪比基線噪聲為1.0 pA·s計算本方法檢出限，各項數(shù)據(jù)詳見表2。

表1 各樣品的檢測結(jié)果Table1 Results of each sample

表2 脫氫乙酸、4種對羥基苯甲酸酯的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table2 Linear relationship，correlation coefficient and detection limit of dehydroacetic acid and four kinds of p-hydroxybenzoate

由表2的數(shù)據(jù)可以看出本方法檢出限以及各項數(shù)據(jù)均滿足目前國內(nèi)食品中脫氫乙酸及對羥基苯甲酸酯類的檢測要求。

2.4 回收率及精密度

取陰性樣品5 g進行測定，以線性濃度的20、50、100 μg/mL為加標濃度，按照上述1.2前處理方法進行處理分析測定，每個加標濃度平行加標3次，以標準物質(zhì)保留時間定性，外標法定量，計算出脫氫乙酸和4種對羥基苯甲酸酯的回收率和相對標準偏差，各項目的3次加標回收率以及相對標準偏差的結(jié)果詳見表3。

表3 各濃度平均值及加標回收率和相對標準偏差（n=3）Table3 Average concentration，standard recovery and relative standard deviation（n=3）

表3表明該方法精密度和準確度、重現(xiàn)性良好，本方法能夠滿足分析要求。

3 結(jié)論

脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯都是食品中常見的防腐劑，為了保證食品的安全，很有必要建立一種快速、高效低成本低且實用的方法，本方法為毛細管柱氣相色譜法不只對果蔬汁及調(diào)味料的檢測，對大部分食品都適用。從分析角度上講科學(xué)性和可操作性優(yōu)于目前國內(nèi)外標準且分析時間短、準確性高、溶劑用量少，能滿足大批量樣品檢測要求。