QuEChERS-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測辣椒中33種農(nóng)藥殘留

李海暢，方志青，鄒云云，陳璐瑩

（1.貴州省貴陽市疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550002；2.貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴陽550025）

辣椒現(xiàn)已成為一種世界性僅次于豆類、番茄的第三大蔬菜作物。在中國，辣椒是僅次于大白菜的第二大蔬菜作物。中國的辣椒總產(chǎn)量居世界之首，年產(chǎn)2 800多萬噸[1]。在貴州辣椒是一種傳統(tǒng)種植作物，栽培歷史悠久，貴州全省山多林茂，氣候溫和濕潤，各地都適宜栽培辣椒。辣椒生長過程中為了防止病蟲害和致病菌影響會噴灑農(nóng)藥，最終會在辣椒上產(chǎn)生農(nóng)藥殘留[2]，由于農(nóng)藥會在人體內(nèi)聚積而引發(fā)疾病[3-6]，因此辣椒上的農(nóng)藥殘留對辣椒出口產(chǎn)生影響[7]。

目前檢測辣椒中農(nóng)藥殘留的方法主要有氣相色譜法[8-12]，液相色譜法[13-14]，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測[15]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16-19]等，大多是同時檢測少量農(nóng)藥或者同一類農(nóng)藥。而用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法同時檢測辣椒中多種農(nóng)藥殘留的報道文獻(xiàn)較少，而單一的液相色譜和氣相色譜檢測農(nóng)藥種類有限，精密度和準(zhǔn)確度比較低，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，不僅可以同時檢測多種農(nóng)藥，并且運用選擇離子監(jiān)控模式可以降低基質(zhì)干擾，提高檢測方法的精密度和準(zhǔn)確度。

本研究針對辣椒中33種常用農(nóng)藥殘留的前處理方法，優(yōu)化 QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）前處理過程，結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，建立了檢測辣椒中33種農(nóng)藥殘留的快速檢測方法，方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，快速簡單交叉污染率低，適用于多種辣椒中的多種農(nóng)藥殘留量的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

33種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品純度在99.2%～99.5%：德國Dr.Ehrenstorfer公司。分別準(zhǔn)確稱取10 mg各種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶，用乙腈溶解后配制成200 mg/L的農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18℃冰箱避光保存。

乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；N-正丙基乙二胺（PSA：40 μm～60 μm，色譜純）、十八烷基鍵合相硅膠（C18，色譜純）：博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent6890-5973MSD氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30.0m×250μm×0.25μm）：美國安捷倫公司；TGL-20B高速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；BUCHI R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SG8200HDT超聲波清洗器：上海冠特超聲儀器有限公司。

1.3 前處理條件

準(zhǔn)確稱取10.0 g切碎且混合均勻的辣椒（通過食品安全風(fēng)險監(jiān)測篩查過的無農(nóng)藥殘留的陰性樣品）于50 mL具塞離心管，加入提取液乙腈20 mL，超聲輔助提取15 min，加入6 g氯化鈉渦旋1 min，于6 000 r/min離心5 min，移液管準(zhǔn)確移取上清液10 mL于梨形瓶，42℃水浴減壓脫除溶劑，1 mL乙腈溶解濃縮物，再轉(zhuǎn)入盛有100 mg N-正丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA），100 mg C18 的 10 mL 離心管，渦旋 1 min，過0.45 μm濾膜，GC-MS檢測。

1.4 儀器條件

色譜工作條件：進(jìn)樣口溫度280℃；進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；載氣為高純氦氣，流速2 mL/min，柱流量2.0 mL/min；柱箱升溫程序為初始60℃，然后以8℃/min升溫至120℃，保持2 min，再以7℃/min升溫至180℃，保持2 min，再以5℃/min升溫至290℃，保持5 min，共計47.07 min。

質(zhì)譜工作條件：四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；接口溫度280℃；采集方式SIM（selected ions monitoring：選擇離子監(jiān)控模式，各組分母離子、子離子見表1）；溶劑延遲3.5 min。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table1 Mass comndition

續(xù)表1 質(zhì)譜參數(shù)Continue table 1 Mass comndition

圖1 辣椒空白樣品A組檢測譜圖Fig.1 Chromatogram of matrix blank pepper sample as group A

圖2 辣椒空白樣品B組檢測譜圖Fig.2 Chromatogram of matrix blank pepper sample as group B

圖3 空白辣椒添加A組標(biāo)樣回收譜圖Fig.3 Chromatogram of blank pepper fortified group A

圖4 空白辣椒添加B組標(biāo)樣回收譜圖Fig.4 Chromatogram of blank pepper fortified group B

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

運用一根色譜柱將33種農(nóng)藥的保留時間完全分開是較為困難的，因此按照出峰時間將33種農(nóng)藥分成兩組分別檢測，減少離子串?dāng)_。

選擇不同進(jìn)樣口溫度進(jìn)行考察，從250℃到300℃，得出在280℃時各組分氣化充分，響應(yīng)最大，且各農(nóng)藥未見分解，所以選擇進(jìn)樣口溫度為280℃。

在1.0 mL/min～2.1 mL/min范圍內(nèi)，從分離度和檢測效率，考察載氣流量。經(jīng)過比較，選擇載氣流量為2.0 mL/min。

對程序升溫進(jìn)行優(yōu)化，以分離情況和分析周期作為考察因素，最終確定程序升溫模式為初始60℃，然后以8℃/min升溫至120℃，保持2 min，再以7℃/min升溫至180℃，保持2min，再以5℃/min升溫至290℃。此時色譜整體情況最好?？瞻讟悠芳凹訕?biāo)樣品分離情況見圖1～圖4。

2.2 試驗方法優(yōu)化

2.2.1 提取方式的選擇

對比超聲提取與勻漿提取的基質(zhì)效應(yīng)。勻漿提取中乙腈層和水層難以分層，且測定結(jié)果基質(zhì)雜質(zhì)峰明顯增多，干擾了目標(biāo)物的檢測。超聲提取能較易的使乙腈與水進(jìn)行分層且操作簡單，實際檢測過程中也反應(yīng)出了其對比勻漿提取能夠大幅減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾，是更為優(yōu)異的提取方式，所以本研究選擇超聲提取。

2.2.2 提取劑的選擇

分別以20 mL二氯甲烷、乙腈-二氯甲烷體積比1∶1、乙腈-二氯甲烷體積比3∶1，乙腈-甲苯體積比3∶1及乙腈-水體積比3∶1、乙腈-水體積比4∶1、乙腈作為提取溶劑，考察提取效率。乙腈-甲苯的回收率雖然大部分農(nóng)藥滿足殘留準(zhǔn)則要求，但是普遍偏低；乙腈-二氯甲烷提取的回收率變化范圍比較大，不能滿足所有農(nóng)藥；乙腈-水的變化范圍也比較大不能滿足多殘留檢測；當(dāng)用乙腈提取時對大部分農(nóng)藥有較高的提取效率，滿足試驗要求，所以本研究選擇純乙腈作為提取劑。

2.2.3 提取次數(shù)的優(yōu)化

制備含有農(nóng)藥0.10 mg/kg和1.00 mg/kg的加標(biāo)樣品，分別用乙腈進(jìn)行3次萃取，每次20.00 mL，超聲提取15 min，分離完全萃取液，再進(jìn)行下一次萃取。將每一次萃取液上機測定，分別測定回收效率。結(jié)果顯示，兩個濃度組，第一次萃取的萃取效率均超過90%，第二次萃取效率低于5%，第三次萃取已基本不能檢出待測農(nóng)藥，所以本研究選用20 mL乙腈超聲提取一次。

2.2.4 氯化鈉用量

辣椒含水量高，需要用氯化鈉使乙腈和辣椒中的水分層，試驗發(fā)現(xiàn)氯化鈉用量不足，導(dǎo)致離心后分層不徹底，乙腈中還有少量水，不利于下一步脫溶劑操作，氯化鈉過多，會對回收率產(chǎn)生影響。若室溫情況下在除水試劑中加入無水硫酸鎂，無水硫酸鎂吸水的同時，放出熱量，和基質(zhì)形成結(jié)塊，影響提取效果，導(dǎo)致回收率下降。故本研究最終選擇單以6 g氯化鈉作為脫水劑。

2.2.5 PSA用量的考察

確定氯化鈉用量后，考察PSA加入量對凈化效果的影響。在1 mL溶解液中分別加入20、50、100、150、200 mgPSA，對33種農(nóng)藥平均回收率的影響見圖5。

試驗發(fā)現(xiàn)，隨著PSA的加入，溶液顏色逐漸變淺，并且農(nóng)藥的平均回收率逐漸提高（達(dá)到95%左右），并且回收率達(dá)到60%～120%的農(nóng)藥比例額明顯增多；而PSA用量達(dá)到100 mg時基本達(dá)到平衡，過量加入反而不利于回收率。而石墨化碳（graphitized carbon black，GBC）雖然對色素有強烈的吸附，但是同時對異丙威、抗蚜威、氟樂靈、甲基毒死蜱等含有平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥有較大吸附[20]，影響整體回收率。

2.2.6 C18用量考察

通過2.2.5確定PSA用量為100 mg后，考察C18用量對效果的影響，在1 mL溶解液中分別加入20、50、100、150、200 mgC18。試驗發(fā)現(xiàn)，C18 的加入對回收率影響不大，但是空白樣品的基線噪聲明顯下降，說明C18有一定的凈化效果，并且加入100 gC18基本使結(jié)果達(dá)到平衡。因此本研究采用100 mgPSA，100 mg C18作為凈化劑。

2.2.7 半量法

雖然使用氯化鈉實現(xiàn)了乙腈與水層的分離，但要將20 mL乙腈層完全轉(zhuǎn)移至下一步濃縮操作是非常困難的，因此選擇半量法，準(zhǔn)確移取10 mL乙腈層進(jìn)行濃縮，降低試驗的操作難度，提高試驗的準(zhǔn)確度與精密度。

圖5 1 mL溶解液中PSA用量對33種農(nóng)藥平均回收率的影響Fig.5 Effect of the amount of PSA added in 1 mL extract on the average recoveries of the 33 pesticides

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照1.3處理空白辣椒樣品，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度范圍為0.4 μg/mL～20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機測定，以樣品濃度對質(zhì)譜響應(yīng)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明各農(nóng)藥在所示濃度范圍與面積線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

2.3.2 方法的檢出限與定量下限

測定空白樣品基線噪聲響應(yīng)值，3倍響應(yīng)值對應(yīng)的農(nóng)藥濃度為檢出限，10倍響應(yīng)值對應(yīng)的農(nóng)藥濃度為方法定量下限，結(jié)果如表2所示，33種農(nóng)藥的檢出限在0.02 μg/kg～4.6 μg/kg之間，方法定量限在 0.07 μg/kg～15.3 μg/kg之間。

2.3.3 方法的回收率和精密度

稱取18份空白辣椒樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，分別按照 25、80、150 μg/kg 3 個添加濃度，每個濃度做 6 個平行樣品，結(jié)果如表2所示，平均回收率為74.31%～119.72%，精密度為2.0%～15.3%。

表2 各農(nóng)藥的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、回收率（n=6）、檢出限及定量限Table2 Linear equation，correlation coefficient，recoveries（n=6），LOD and LOQ of 33 pesticides

續(xù)表2 各農(nóng)藥的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、回收率（n=6）、檢出限及定量限Continmue table 2 Linear equation，correlation coefficient，recoveries（n=6），LOD and LOQ of 33 pesticides

續(xù)表2 各農(nóng)藥的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、回收率（n=6）、檢出限及定量限Continmue table 2 Linear equation，correlation coefficient，recoveries（n=6），LOD and LOQ of 33 pesticides

2.4 實際樣品檢測

采用本研究所建立的方法對貴陽花溪2個大型超市采購的4種辣椒（包括美人椒、黃皮大尖椒、紅辣椒、朝天椒）樣品進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果：黃皮大尖椒有抗蚜威和甲霜靈檢出，朝天椒有甲霜靈檢出，紅辣椒有腐霉利檢出，均小于國家要求的最大殘留限量。目前市售的辣椒的農(nóng)藥殘留含量相對安全。

3 總結(jié)

通過對辣椒樣品中多種農(nóng)藥的殘留分析方法的氣相色譜條件的摸索、前處理條件的篩選以及定性定量分析方法的確定，建立了一套相對完整、操作簡單、準(zhǔn)確可靠的檢測辣椒中多種農(nóng)藥殘留的分析方法。試驗結(jié)果表明該方法的靈敏度高、精密度和準(zhǔn)確性較好，且可有效的補償消除了基質(zhì)效應(yīng)對準(zhǔn)確度與精密度的影響，從而可滿足了農(nóng)藥殘留檢測分析的要求。