不同前處理方式對(duì)米糠復(fù)合酶解效果影響的研究

韓雅盟，池建偉，張名位，韓素云，魏振承，林耀盛，范三紅，*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510610）

我國(guó)的稻米產(chǎn)量位居世界首位，米糠作為稻米精碾過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，資源豐富，同時(shí)富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、膳食纖維以及微量元素、維生素、多酚等多種生理活性物質(zhì)。然而，米糠在加工利用中常常容易腐敗、味道變差并且伴有不易蒸煮、口感粗糙等問(wèn)題，使其在農(nóng)副產(chǎn)品中的應(yīng)用受到了嚴(yán)重的限制，因此通過(guò)合適的前處理來(lái)改進(jìn)米糠的加工性狀成為米糠在加工利用中急需解決的問(wèn)題[1-2]。此外，由于米糠的基本營(yíng)養(yǎng)素大都與其細(xì)胞壁聯(lián)結(jié)在一起，存在較差的溶解性，不便利用，因此使用酶工程來(lái)更改米糠細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，將結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)物質(zhì)，并使其細(xì)胞壁上可溶性物質(zhì)溶解出來(lái)，逐漸成為國(guó)內(nèi)外農(nóng)副產(chǎn)品加工利用的重要手段。

世界上有關(guān)改善米糠加工利用性狀的研究報(bào)道十分廣泛。歐克勤等[3]研究中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶以及堿性蛋白酶對(duì)米糠中蛋白質(zhì)溶解性的影響，結(jié)果顯示中性蛋白酶酶解米糠與風(fēng)味蛋白酶及堿性蛋白酶相比具有更好的溶解性。王雪飛等[4]使用纖維素酶能增加米糠蛋白的提取率。唐卿雁等[5]利用果膠酶和纖維素酶催化浸提米糠油，提高了米糠油的得率；Shih等[6]通過(guò)使用糖苷酶來(lái)降解米糠中淀粉和纖維素，得到新型功能食品原料，然而其原料利用率不到30%，限制了應(yīng)用。Parrado等[7]在堿性條件下采用復(fù)合內(nèi)切蛋白酶酶解米糠制得多肽，同時(shí)其酶解液具有抗腫瘤的功能。現(xiàn)階段，擠壓膨化、微波蒸煮和高溫焙炒等加工方式是農(nóng)副產(chǎn)品加工利用的重要手段。Jennifer等[8]采用擠壓膨化處理麥麩，發(fā)現(xiàn)其水溶性非淀粉多糖含量得到提高，但是其多酚含量及其抗氧化活性降低。趙穎等[9]研究了擠壓膨化對(duì)萌芽糙米品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)擠壓膨化能改善糙米的沖調(diào)分散性，同時(shí)最大程度保留萌芽糙米的營(yíng)養(yǎng)成分。Garcia等[10]采用微波處理米糠，產(chǎn)生濃郁的香甜味道，植酸含量下降，食用品質(zhì)得到改善，米糠的穩(wěn)定性得到提高。

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)米糠的研究主要集中在米糠穩(wěn)定化及其單一營(yíng)養(yǎng)組分的提取分離，對(duì)米糠整體加工利用的研究較少，造成米糠加工利用率低。雖然酶工程已經(jīng)應(yīng)用于米糠的加工利用，但是不同前處理對(duì)米糠酶解效果的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文以脫脂米糠為原料優(yōu)化建立脫脂米糠復(fù)合酶解工藝條件并進(jìn)一步將不同前處理技術(shù)與酶解技術(shù)相結(jié)合，比較擠壓膨化、微波蒸煮和高溫焙炒3種前處理方式對(duì)米糠酶解效果的影響，旨在為米糠在食品中深度加工利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮全脂米糠：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供，過(guò)40目篩去雜，于-18℃密封保存?zhèn)溆?；脫脂米糠：采用亞臨界萃取方法，脂肪含量為（1.0±0.2）%；纖維素酶（35 000 U/g）：廣州齊云生物技術(shù)有限公司；α-淀粉酶（20 000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；沒(méi)食子酸和兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品：上海Aladdin公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CBE-5L亞臨界流體萃取實(shí)驗(yàn)室成套裝置：河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司；DS32型雙螺桿擠壓膨化機(jī)：濟(jì)南賽信膨化機(jī)械有限公司；DHG-9425A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；格蘭仕G90W-25MSP-WB微波爐：格蘭仕電器有限公司；K8400半自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；TD6離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；Eyelan-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會(huì)社；Tecan Infinite M200多功能酶標(biāo)儀：瑞士Tecan科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合酶解米糠工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.1.1 酶解工藝流程

脫脂米糠+水（1∶15，g/mL）混合→均質(zhì)→加入纖維素酶，α-淀粉酶→酶解→滅酶→離心（4 400 r/min，30 min）→上清液備用。

工藝要點(diǎn)如下：

1）均質(zhì)：脫脂米糠+水（1∶15，g/mL）混合均勻后在高速均質(zhì)機(jī)上均質(zhì)3 min。

2）滅酶：將酶解米糠置于沸水浴中10 min滅酶。

1.3.1.2 復(fù)合酶酶解米糠工藝單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)確立了復(fù)合酶組成：纖維素酶與α-淀粉酶。以可溶性固形物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別評(píng)價(jià)酶配比、溫度、pH值和復(fù)合酶添加量對(duì)酶解效果的影響。具體條件如下：

1）酶配比：固定料液比 1 ∶15（g/mL），復(fù)合酶添加量1.50%，溫度48℃，反應(yīng)時(shí)間1.0 h，pH 5.3，酶質(zhì)量比設(shè)定為 1∶0、0∶1、0.5∶1、1.5 ∶1、2.5 ∶1。

2）溫度：固定料液比 1 ∶15（g/mL），酶質(zhì)量比 1.5 ∶1，復(fù)合酶添加量 1.50%，反應(yīng)時(shí)間 1.0 h，pH 5.3，溫度設(shè)定為 43、48、53、58、63 ℃。

3）pH 值：固定料液比 1 ∶15（g/mL），酶質(zhì)量比 1.5 ∶1，復(fù)合酶添加量1.50%，溫度48℃，反應(yīng)時(shí)間1.0 h，pH 值設(shè)定為 4.3、4.8、5.3、5.8、6.3。

4）復(fù)合酶添加量：固定料液比 1 ∶15（g/mL），酶質(zhì)量比 1.5∶1，溫度 48℃，反應(yīng)時(shí)間 1.0 h，pH 5.3，復(fù)合酶添加量設(shè)定為1.20%、1.50%、1.80%、2.10%、2.40%。

1.3.1.3 復(fù)合酶酶解米糠多因素響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、酶添加量和pH值為自變量，固定纖維素酶與α-淀粉酶酶質(zhì)量比為1.5∶1，以可溶性固形物含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素水平編碼表見(jiàn)表1。試驗(yàn)處理設(shè)3次重復(fù)。

表1 因子水平編碼表Table1 Experimental factors and coding levels in response surface design

1.3.2 不同前處理方式

1）擠壓膨化：控制水分含量為20%，擠壓溫度

1.3.3.2 酶解米糠可溶性糖含量的測(cè)定

將米糠酶解上清液過(guò)濾后稀釋到一定濃度，取稀釋液0.5 mL于20 mL試管中，加入1.5 mL去離子水，0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯溶液和5 mL濃硫酸，混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確保溫1 min，取出后冷卻，于波長(zhǎng)630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.008 0X+0.015 2（R2=0.999 4）165℃，擠壓物于55℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒重，粉碎過(guò)80目篩，裝入密封袋，-4℃保存。

2）微波蒸煮：650 mL圓形耐熱玻璃碗中稱(chēng)取30 g脫脂米糠，控制水分含量為40%，微波功率440 W，加熱90 s后于55℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒重，粉碎過(guò)80目篩，裝入密封袋，-4℃保存。

3）高溫焙炒：稱(chēng)取100 g脫脂米糠放入鍋中，加熱至米糠表面溫度達(dá)到90℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，不間斷翻炒9 min，冷卻后，粉碎過(guò)80目篩，裝入密封袋，-4℃中保存。

1.3.3 不同前處理米糠酶解特性試驗(yàn)

調(diào)整纖維素酶與α-淀粉酶復(fù)合酶解米糠液pH值至6.5，4 400 r離心30 min，取酶解上清液進(jìn)行米糠酶解特性試驗(yàn)。

1.3.3.1 酶解米糠可溶性蛋白含量的測(cè)定

采用GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法測(cè)定酶解上清液和脫脂米糠粉中蛋白含量。

1.3.3.3 酶解米糠總酚含量的測(cè)定

參照Singleton[11]的方法并略做修改。將米糠酶解上清液過(guò)濾后稀釋到一定濃度，取稀釋液1.25 mL，加入0.5 mL去離子水和0.125 mL福林酚試劑，混勻，靜置6 min后加入1 mL去離子水和1.25 mL 7%Na2CO3溶液，混勻，避光靜置90 min，于波長(zhǎng)760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，同時(shí)以0.125 mL甲醇代替米糠酶解液作空白對(duì)照，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.005X+0.015 9（R2=0.996 8），總酚含量以每100 g米糠干基中所含沒(méi)食子酸當(dāng)量表示簡(jiǎn)寫(xiě)為mg GAE/100 g DW。

1.3.3.4 酶解米糠總黃酮含量的測(cè)定

參照Z(yǔ)hishen等[12]的方法并略做修改。將米糠酶解上清液過(guò)濾后稀釋到一定濃度，取稀釋液0.3 mL，加入0.09 mL 5%NaNO2和1.5 mL去離子水，混勻，靜置6 min后加入0.18 mL 10%AlCl3·6H2O溶液，混勻，靜置5 min后再加入0.6 mL 1 mol/L NaOH溶液，最后用去離子水補(bǔ)足至3 mL，于波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光值，同時(shí)以0.3 mL甲醇代替米糠酶解液作空白對(duì)照，以?xún)翰杷貥?biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.003 9X+0.015 2（R2=0.998 3），總黃酮含量結(jié)果以每100克米糠干基中所含的兒茶素當(dāng)量表示，簡(jiǎn)寫(xiě)為mgCE/100gDW。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

采用用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Means±SD）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯著差異水平為p<0.05，響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design expert軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠復(fù)合酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶質(zhì)量比

酶質(zhì)量比對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響如圖1-（a）所示。只添加纖維素酶或α-淀粉酶時(shí)米糠的可溶性固形物含量較低，尤其是在只添加纖維素酶時(shí)最低；當(dāng)纖維素酶和α-淀粉酶的質(zhì)量比為1.5∶1時(shí)，米糠可溶性固形物含量達(dá)到最大值32.65%。

2.1.2 溫度

溫度對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響如圖1-（b）所示。米糠的可溶性固形物含量隨著溫度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，在48℃達(dá)到最大值33.24%。當(dāng)溫度超過(guò)48℃后，提取率開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)闇囟鹊陀?8℃時(shí)α-淀粉酶的活性會(huì)降低，但溫度升高時(shí)候纖維素酶的活性又會(huì)受到抑制。

2.1.3 pH值

pH值對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響如圖1-（c）所示。米糠的可溶性固形物含量隨著pH值的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，在pH4.8達(dá)到最大值33.37%。pH值大于4.8后，提取率下降顯著。這是因?yàn)槔w維素酶的最適pH值在3.5～5.0，而α-淀粉酶的最適pH值在5.0～8.0，pH 4.8左右剛好在兩種酶最適pH值的交界處，因而酶解效果最佳。

2.1.4 復(fù)合酶添加量

復(fù)合酶添加量對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響如圖1-（d）所示。米糠的可溶性固形物含量隨著復(fù)合酶添加量的增大呈上升趨勢(shì)，復(fù)合酶添加量小于1.8%時(shí)增加明顯，添加量大于1.8%后無(wú)顯著變化。這是由于隨著酶添加量的不斷增大，已經(jīng)沒(méi)有可以被纖維素酶和α-淀粉酶作用的底物存在。

圖1 不同復(fù)合酶酶解條件對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響Fig.1 Effects of different complex enzymatic hydrolysisconditions on the content of soluble solids ofdefatted rice bran

2.2 米糠復(fù)合酶解的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

分別以X1（溫度）、X2（復(fù)合酶添加量）和X3（pH值）為自變量，并以-1、0、1 分別代表低、中、高水平，以米糠可溶性固形物含量為響應(yīng)值Y，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件Design expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)過(guò)多元回歸擬合，得到回歸方程模型：

由回歸模型的方差分析（見(jiàn)表3）可知，各因素對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響強(qiáng)弱依次為溫度＞pH值＞復(fù)合酶添加量，其中酶解溫度對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響達(dá)到了極顯著水平。回歸模型顯著（p=0.0114＜0.05）。擬合模型相關(guān)系數(shù)R2=0.940 0，失擬項(xiàng)不顯著（p=0.116 9＞0.05），說(shuō)明該回歸方程的擬合度高，可較好地描述各因素于響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系。模型給出的最佳酶解條件為酶添加量為1.8%，酶解溫度50.8℃，pH5.1，在此條件下米糠可溶性固形物含量理論值達(dá)到35.86%。

表2 試驗(yàn)方法及試驗(yàn)結(jié)果Table2 Experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table3 Results of regression and variance analysis

圖2顯示了酶用量與酶解溫度對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響，它們對(duì)米糠可溶性固形物含量的影響呈顯著交互作用。固定酶解的pH值在零水平，酶解初始階段，隨著酶解溫度和酶添加量的增加，米糠的可溶性固形物含量逐漸增高，但當(dāng)酶添加量達(dá)到一定水平后，可溶性固形物含量不再發(fā)生明顯的變化，超過(guò)一定溫度后，提高酶解溫度會(huì)略微降低米糠可溶物的提取率。同時(shí)可以看出，降低酶解溫度對(duì)可溶性固形物含量的影響可以通過(guò)增加酶用量得以改善，反之亦然。

圖2 復(fù)合酶添加量與酶解溫度對(duì)米糠可溶性固形物含量的交互作用Fig.2 Interaction of complex enzyme concentration and temperature on the content of soluble solids ofdefatted rice bran

為檢驗(yàn)響應(yīng)面設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行試驗(yàn)?？紤]到實(shí)際操作條件，將酶解工藝條件調(diào)整為酶添加量1.8%，酶解溫度51.0℃，pH 5.1。在此條件下，米糠的可溶性固形物含量為35.06%，與理論值相比相差0.80%，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.3 不同加工方式對(duì)米糠酶解效果的影響

2.3.1 可溶性蛋白和可溶性糖

不同前處理方式對(duì)復(fù)合酶解米糠中可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響見(jiàn)表4。

表4 不同前處理方式對(duì)復(fù)合酶解米糠中可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Table4 Effects of different pretreatment on the content of soluble protein and soluble sugar of defatted rice bran by composite enzymatic treatments

由表4可知，與未處理相比，3種前處理方式均顯著降低了復(fù)合酶解米糠中可溶性蛋白含量（p＜0.05），擠壓膨化、微波蒸煮、高溫焙炒分別使酶解米糠中可溶性蛋白含量下降了9.04%、3.36%、4.44%。這主要是因?yàn)榍疤幚硎沟妹卓分械鞍装l(fā)生了熱變性，原先包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)的水溶性降低，擠壓膨化處理由于自身加工條件更劇烈，因而對(duì)復(fù)合酶解米糠中可溶性蛋白含量影響更為顯著[13]。

與未處理組相比，擠壓膨化和微波蒸煮顯著提高了復(fù)合酶解米糠中可溶性糖含量（p＜0.05），分別上升了8.37%、3.77%。高溫焙炒對(duì)復(fù)合酶解米糠中可溶性糖含量無(wú)顯著影響（p＞0.05）。這可能是因?yàn)榍皟煞N處理能夠較大程度提高米糠中淀粉的糊化度，糊化的淀粉更易被淀粉酶酶解。

周小理等[14]發(fā)現(xiàn)擠壓膨化可以對(duì)膳食纖維改性，提高原料中可溶性膳食纖維含量；李杰等[15]發(fā)現(xiàn)擠壓膨化前處理可以促進(jìn)米糠多糖的溶出；鄭喜群等[16]采用擠壓膨化的方法預(yù)處理玉米粉，可提高Alcalase酶解玉米粉的水解度；杜雙奎等[17]發(fā)現(xiàn)擠壓膨化可以使物料中的淀粉降解，生成小分子量物質(zhì)，水溶性增強(qiáng)，因而擠壓膨化酶解米糠具有更高的可溶性糖含量。

2.3.2 酚類(lèi)物質(zhì)含量

米糠中的多酚自然狀態(tài)下常常與米糠中的蛋白質(zhì)、淀粉等結(jié)合，石碧等[18]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用復(fù)合酶，蛋白酶酶解處理米糠時(shí)可以使米糠中的多酚釋放出來(lái)；何新益等[19]發(fā)現(xiàn)糙米發(fā)芽處理可以提高糙米的多酚含量，而發(fā)芽的過(guò)程就是稻谷中大量?jī)?nèi)源酶，如糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶等被激活和釋放過(guò)程。

不同前處理方式對(duì)復(fù)合酶解米糠中總酚和總黃酮含量的影響見(jiàn)表5。

表5 不同前處理方式對(duì)復(fù)合酶解米糠中總酚和總黃酮含量的影響Table5 Effects of different pretreatment on the content of total phenols and flavonoids of defatted rice bran by composite enzymatic treatments

由表5可知，與未處理組相比，擠壓膨化顯著降低了復(fù)合酶解米糠中總酚含量（p＜0.05），下降了4.99%。高溫焙炒處理略微降低了復(fù)合酶解米糠中總酚含量，微波蒸煮對(duì)總酚含量無(wú)明顯影響（p＞0.05）。

與未處理組相比，3種加工方式對(duì)復(fù)合酶解米糠中總黃酮含量均無(wú)顯著影響（p＞0.05）。因而不同前處理方式不會(huì)對(duì)酶解米糠中總黃酮含量產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

以可溶性固形物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，脫脂米糠最適復(fù)合酶解工藝條件為：纖維素酶與α-淀粉酶質(zhì)量比為1.5∶1，復(fù)合酶添加量為 1.8%，溫度 51℃，pH 5.1，米糠可溶性固形物含量達(dá)到35.06%。3種前處理方式均降低復(fù)合酶解米糠中可溶性蛋白含量，但卻提高了可溶性糖含量；擠壓膨化和高溫焙炒降低了復(fù)合酶解米糠中總酚含量；3種前處理方式對(duì)總黃酮含量物均無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果可以為米糠飲料的開(kāi)發(fā)提供指導(dǎo)。