超高壓處理和二氧化氯處理對改善魚糕品質的機制研究

杜杰，沈韞韜，馬良，郭婷，余永，張宇昊（西南大學食品科學學院，重慶400715）

我國是世界上水產品產量最大的國家[1]，近年來我國水產品加工業(yè)發(fā)展迅速，2016年用于加工的水產品達到2 165.44萬噸，占我國水產品總量的31.3%[2]。近年來，海洋資源銳減，淡水魚產量呈現較快增長，加工利用淡水魚成為了我國水產品的加工方向[3]。但我國淡水魚加工相對落后，目前加工總量不足淡水魚總量的15%，嚴重制約了淡水魚業(yè)的發(fā)展[4]。

魚糜是指魚肉經過采肉、漂洗、精濾等工序制得的濕的肌原纖維蛋白濃縮物，屬于完全蛋白[5]。魚糜制品是指向魚糜中加入2%～3%的食鹽，經過25 min的空擂、鹽擂和調味擂，成型加熱后制得的富有彈性的水產品[6]。魚糜制品加工便利，富有多種能被人體吸收利用的優(yōu)質蛋白，能滿足人們對低脂肪、低膽固醇的要求，是一種發(fā)展前景很好的水產食品[7]。魚糜制品是生產和消費量最大的水產品之一，也是我國最大宗的水產加工制品之一，在全球范圍內具有很大的市場潛力和發(fā)展前景，2000年至2008年我國魚糜制品年產量以28.86%的復合增長率遞增[8]。實現淡水魚產業(yè)發(fā)展的途徑之一就是把低值淡水魚轉化、加工成易運輸、食用方便的魚糜制品。

湖北荊州地區(qū)素有制作食用魚糕的傳統(tǒng)，是我國淡水魚糜制品的主要加工地之一。目前該地區(qū)已有企業(yè)通過簡單的真空包裝魚糕面向市場銷售，但保質期一直制約著該產品實現規(guī)模生產。一些企業(yè)嘗試通過高溫殺菌處理延長產品的保質期，但高溫殺菌會造成產品的口感及產品的顏色出現明顯劣變。

本研究基于現存的問題，在魚糕傳統(tǒng)生產工藝中增加減菌程序，分別采用超高壓和二氧化氯（ClO2）處理對魚糕進行減菌，探究二者對延長魚糕保質期的效果，評價處理手段對魚糕在貯藏期內的品質影響，并對其影響魚糕品質變化的機理進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鰱魚：重慶市北碚區(qū)雄風超市。

二氧化氯（食品級）：山東華實藥業(yè)；氧化鎂、硼酸、三氯乙酸、鹽酸、冰乙酸（分析純）：成都市科龍化學試劑廠；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，分析純）：天津市大茂化學試劑廠；三羥甲基氨基甲烷（Tris，優(yōu)級純）：BIO BASIC公司；質量分數為30%丙烯酰胺（優(yōu)級純）：北京索萊寶科技有限公司；甘氨酸（Glycine，分析純）：生工生物工程（上海）有限公司；考馬斯亮藍R-250（優(yōu)級純）：BIO BASIC公司；標準蛋白（分子量 10 kDa～200 kDa，分析純）：加拿大 Fermentas公司；平板計數瓊脂（plate count agar，PCA，生物試劑）：杭州微生物試劑有限公司；0.9%氯化鈉注射液（生物試劑）：廣西裕源藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（JA3003B）：上海精天電子儀器有限公司；溫控水浴鍋（8002）：北京永光明醫(yī)療儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（101-4-S）：上海躍進醫(yī)療儀器廠；基礎電泳儀（Power PacTM）：美國 Bio-Rad公司；質構儀（CT-3）：美國博勒飛公司；高速分散器（XHF-DF）：寧波新芝生物科技股份有限公司；真空包裝機（DZ-600-2S）：雙豐儀器制造公司；拉曼光譜儀（DXR2i）：賽默飛世爾科技。

1.3 鰱魚魚糕的制作工藝及操作要點

新鮮鰱魚→剖殺→采肉（去魚皮、紅肉、魚刺）→漂洗→擂潰→成型→蒸制→真空包裝→4℃冰箱冷藏

1.3.1 剖殺

新鮮鰱魚購買后，立即剖殺，去除頭、尾、內臟，清洗干凈。

1.3.2 采肉

去除魚皮、紅肉及魚刺，并將魚肉切分成小塊。

1.3.3 漂洗

漂洗分3次，清水與魚肉的比例為1∶5（質量比），最后一次漂洗時按照1.5 g/L的比例加入食鹽，漂洗8 min～10 min，并不時攪拌，靜置10 min后用紗布將魚肉絞干。

1.3.4 擂潰

擂潰指將魚肉斬剁成泥并與其它輔料混合均勻的過程。擂潰按照三階段擂潰的方法，即空擂（5 min）、鹽擂（加入食用鹽2.5%～3.0%，15 min）及調味擂。其中調味擂時加入雞蛋清5%，姜汁3%，蔥白汁3%，豌豆淀粉8%，飲用水15%～25%。取少許魚糜置于清水中，魚糜能浮在水面上時即可終止擂潰。

1.3.5 成型

將魚糜分為均勻小塊，并處理成型，一般呈長方狀。

1.3.6 蒸制

將成型魚糜置于沸水蒸鍋中蒸制30 min。

1.3.7 真空包裝

將放至室溫的魚糕裝入真空包裝袋中，采用真空包裝機進行封裝。真空時間為14 s，熱合時間為4 s。

1.3.8 冷藏

置于4℃冰箱中冷藏待用。

1.4 魚糕的減菌處理

將魚糕分為對照組（G）、超高壓組（UG）和ClO2組（ZPG），G組即按以上操作進行；UG組在真空包裝后進行500 MPa，120 s超高壓處理；ZPG組處理方式為在真空包裝袋內壁均勻涂抹3 mL濃度為10 mg/L的ClO2溶液再裝入蒸制好的魚糕，真空包裝。

1.5 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測定

TVB-N含量根據GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進行測定。

1.6 菌落總數的測定

菌落總數根據GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗菌落總數的測定》進行測定。

1.7 pH值的測定

pH值根據GB 5009.237-2016《食品pH值的測定》進行測定。

1.8 持水性的測定

取2 g魚糕攪碎，在離心機中離心（3 000 g，5 min），離心后稱重，得到離心后的水分含量。

1.9 蒸煮損失率

從魚糕上切下2 cm×2 cm×1 cm的小塊，稱重得W1，放入蒸煮鍋中蒸煮5 min后冷卻至室溫，用吸水紙吸去表面水分再次稱重得W2。

1.10 質構特性的測定

將4℃下保存的魚糕切成2 cm×2 cm×2 cm的方塊，使用CT-3質構儀測定魚糕的質構特性。探頭：TA5；測試類型：TPA；測試速度：5 mm/s；觸發(fā)力：5 g?？傻玫接捕?、彈性、咀嚼性、內聚性等參數。每組數據重復測試4次，取平均值。

1.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）電泳分析

SDS-PAGE的測定方法參考了Soottawat Benjakul等[9]，并進行了一些修改。使用均質機將3 g魚糕與27 mL 溶解溶液（2%SDS，8 mol/L 尿素，pH8.8）混合。將勻漿后的樣品在80℃水浴1 h以獲得最大蛋白質溶解和提取，隨后在3 000 g離心15 min，并將上清液用水稀釋至0.2%蛋白質濃度。將處理的蛋白質樣品（0.2%蛋白質濃度）與SDS-PAGE樣品緩沖液（4%SDS，20%甘油，10%b-巰基乙醇，0.125 mol/L Tris，pH6.8）混合（以1∶1，體積比），并在沸水中加熱溶解5 min待用。

電泳采用4%濃縮膠和10%分離膠，上樣量為10 μL，在15 mA下進行電泳直至溴酚藍條紋下降至分離膠和濃縮膠的分界線，將電流切換到25 mA。電泳結束后，使用考馬斯亮藍G-250染色液進行染色，然后使用考馬斯亮藍染色脫色液進行脫色處理，最后進行拍照。其中，考馬斯亮藍G-250染色液的配方為0.5 g考馬斯亮藍G-250，甲醇500 mL，冰醋酸92 mL，蒸餾水408 mL。脫色液配方為冰醋酸75 mL，甲醇50 mL，蒸餾水875 mL。

1.12 拉曼光譜分析

使用賽默飛DRX激光共聚焦拉曼光譜儀測定。激光波長為785 nm，激光能量30 mW，光闌50 μm針孔。記錄400 cm-1～4 000 cm-1的光譜信息。對于光譜分析中，載玻片用錫紙包裹，將少量魚糕樣品放置在載玻片上壓平。樣本分析進行3次平行。根據以前的報告對拉曼光譜進行了校正[10]。收集獲得的信號使用OMNIC軟件處理。

1.13 數據處理

所有結果均以平均值±標準偏差表示。采用Microsoft excel 2010和SPSS 17.0進行數據處理，并用O－rigin8.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 TVB-N值

揮發(fā)性鹽基總氮（TVB-N）是表征魚類產品微生物腐敗程度的一個重要指標。TVB-N主要是源于微生物的增長和內源酶的作用，使蛋白質降解及氨、次級產物、胺類和非蛋白含氮化合物的產生[11]。我國國標（GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》）要求貯藏期間淡水魚和蝦的TVB-N值應小于或等于20 mg/100 g。魚糕貯藏過程中TVB-N變化趨勢如圖1所示。

圖1 鰱魚魚糕貯藏期內TVB-N值的變化Fig.1 Changes of TVB-N value in the storage period of the kamaboko gels

經過不同處理后魚糕的TVB-N在4.4 mg/100 g左右，隨著貯藏天數的增加，所有組別的TVB-N呈現上升趨勢。未處理樣品在第14天時TVB-N達到20.1 mg/100 g，已經超過國家標準。ClO2處理組在貯藏前10天TVB-N值與對照組無顯著差異（P＞0.05），10 d以后TVB-N值上升速度較無處理組開始放緩，19 d時并未達到20 mg/100 g，說明ClO2的抑菌效果在貯藏后期開始顯現。超高壓處理組TVB-N值上升速度在5 d后較另外兩組顯著降低（P＜0.05），在貯藏19 d時為 17.7 mg/100 g，顯著低于 ClO2處理組（P＜0.05），說明超高壓處理較ClO2處理能更好的減緩魚糕在貯存期中的TVB-N的上升。

2.2 菌落總數

菌落總數是指在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH值、培養(yǎng)溫度和時間等）每克（每毫升）檢樣所生長出來的細菌菌落總數。水產制品菌落總數國家限量標準為≤106CFU/g。鰱魚魚糕貯藏期內菌落總數的變化見圖2。

圖2 鰱魚魚糕貯藏期內菌落總數的變化Fig.2 Changes of total plate count in the storage period of the kamaboko gels

所有樣品的菌落總數均隨貯藏時間的延長而增加，未處理組在第10天菌落總數達到5.11 lg（CFU/g），貯藏14 d時未處理組菌落總數已經超過國家限量標準。ClO2處理組在貯藏第10天菌落總數顯著低于未處理組（P＜0.05），但此時TVB-N值與未處理組沒有差異，可能是因為微生物生長與導致TVB-N值的增加存在一定滯后，隨著貯藏時間的進一步延長，ClO2處理組菌落總數較未處理組始終保持在較低水平，且貯藏19 d后超出國家標準。超高壓組菌落總數在貯藏第5天顯著低于未處理組（P＜0.05），TVB-N值則在第10天才與未處理組呈現顯著差異，同樣顯示了菌落總數增長與TVB-N值增長之間有滯后效應存在，在后期貯藏過程中，超高壓組菌落總數顯著低于其他兩個處理組，與TVB-N值變化趨勢一致。

2.3 pH值

正常的魚糕魚丸類水產加工產品，其在貯藏期內的pH值變化不明顯，一般在6.8～7之間。異常的pH值變化通常代表著微生物的大量增殖。腐敗變質產生的典型終產物，氨和三甲胺大量積累導致pH值升高[12]。鰱魚魚糕貯藏期內pH值的變化見圖3。

圖3 鰱魚魚糕貯藏期內pH值的變化Fig.3 Changes of pH value in the storage period of the kamaboko gels

從試驗結果中可以看到，未處理組魚糕在貯藏的后期pH值上升，這是由于微生物的快速生長導致了魚糕的腐敗變質，ClO2和超高壓處理組魚糕的pH值在一個相對穩(wěn)定的范圍內波動。其pH值變化趨勢并不明顯，總體上呈現先略微下降后小幅度上升的趨勢。由于兩個處理組魚糕中菌落總數在整個貯藏過程中增長速度相對較緩且都在標準范圍以內，所以對于其pH值的影響較小。

綜合以上結果，通過超高壓和ClO2涂抹處理，均可明顯的延長魚糕的貨架期，其中超高壓處理效果更優(yōu)。

2.4 持水力

魚糕的持水力反映的是蛋白質與水的結合能力。在魚糕中常作為一個品質評價指標。鰱魚魚糕在貯藏期內持水力的變化見圖4。

圖4 鰱魚魚糕在貯藏期內持水力的變化Fig.4 Change of WHC of the kamaboko gels

由圖4可知，總體上各組持水力隨著貯藏天數的增加而逐漸下降。一些研究者認為，持水力的下降是由于魚糕凝膠網絡穩(wěn)定性的下降和其中水流動性的增長[13]。在貯藏過程中，內源酶和微生物的共同作用，可以使魚糕中蛋白的降解造成蛋白網絡結構被破壞，進而降低魚糕的持水性。

未處理組持水力從第1天的92%下降至第10天的71%。而超高壓組與ClO2處理組第10天時持水力分別為88.6%和87%，這主要是因為ClO2和超高壓處理對微生物及內源酶的抑制所致。在貯藏初期超高壓處理組的持水力明顯高于其他組。原因是超高壓處理可以增加魚糕中蛋白間的氫鍵作用，穩(wěn)定蛋白網絡結構，使之可以容納更多的水分子[14]。

因此，在持水力的保持上，超高壓在貯藏初期能發(fā)揮更好的作用，但在貯藏后期則與ClO2處理組的效果相近。

2.5 蒸煮損失率

魚糕的蒸煮損失率同樣是魚糕品質優(yōu)劣的重要指標。魚糕在貯藏期內蒸煮損失率的變化見圖5。

圖5 魚糕在貯藏期內蒸煮損失率的變化Fig.5 Change of cooking loss of the kamaboko gels

試驗結果表明，蒸煮損失率整體上呈現上升趨勢。魚糕中蛋白質之間形成的網絡結構使水分被束縛在一定的范圍和區(qū)域內，加熱過程中蛋白聚集導致網絡收縮，造成部分水分被“擠出”，產生蒸煮損失。隨著貯藏期的延長蛋白結構展開可能會加劇其在加熱過程中的聚集，進而造成更多的蒸煮損失[15-16]。

與未處理組相對比，整個貯藏過程中超高壓組和ClO2處理組蒸煮損失率較低。原因是超高壓處理可以使魚糕網狀結構變得更加致密，同時也進一步提升了蛋白質對水的束縛力[17]。ClO2組在貯藏過程中蒸煮損失率上升的速度也相對較緩。可能是由于減菌劑對微生物和內源酶的抑制作用減少了蛋白質的降解，更好的保持了魚糕的蛋白結構的完整性。超高壓組與ClO2處理組在整個貯藏過程中蒸煮損失率均為緩慢上升且差異不明顯。因此，ClO2與超高壓處理組均可有效的穩(wěn)定魚糕的蛋白結構進而降低蒸煮損失率。

2.6 質構（TPA）

質構數據可從多方面表現魚糕的物理性質。硬度是人體對于觸覺柔軟堅硬的感覺，表征用來保持原有形狀的內部結合力[18]。彈性則是指魚糕變形后恢復原本形狀的能力。內聚性是指分解魚糕內部結合所需要的能量。而咀嚼性是指在咀嚼魚糕過程中需要的能量[19]。鰱魚魚糕在貯藏期內質構的變化見圖6。

試驗結果顯示，總體而言隨著貯藏天數的增加，魚糕質構指標呈現下降趨勢，說明其質構品質逐漸劣變。整個貯藏過程中，UG組魚糕質構指標均顯著高于G組和ZPG組。原因在于超高壓可能促進了魚糕蛋白體系中氫鍵的形成；貯藏后期ZPG組的質構逐漸優(yōu)于未處理組，與持水性變化規(guī)律一致?？傮w而言，魚糕在貯藏過程中的品質發(fā)生劣變，這主要與蛋白的降解及構象變化有關，因此通過進一步研究貯藏過程中魚糕中蛋白質變化規(guī)律，明確不同處理后魚糕品質劣變機制的差異。

圖6 鰱魚魚糕在貯藏期內質構的變化Fig.6 Change of TPA of the kamaboko gels

圖7 鰱魚魚糕在貯藏期內SDS-PAGE電泳分析Fig.7 SDS-PAGE electrophoretic analysis of the kamaboko gels during storage

2.7 魚糕在貯藏期內SDS-PAGE分析

鰱魚魚肉的肌原纖維蛋白是一個比較復雜的蛋白體系。其中在SDS-PAGE分析中，幾條較為明顯的條帶分別是，肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白、肌原蛋白和肌球蛋白輕鏈。其中肌球蛋白重鏈和肌動蛋白是最主要的蛋白條帶。鰱魚魚糕在貯藏期內SDSPAGE電泳分析見圖7。

由圖7可知，隨著貯藏期的延長，未處理組肌球蛋白重鏈出現一定程度的變淺，在貯藏期末尾，肌球蛋白重鏈已經明顯淺于貯藏初期。說明在貯藏過程中肌原纖維蛋白發(fā)生了降解。隨貯藏時間延長，超高壓組肌球蛋白重鏈也發(fā)生了明顯降解。說明超高壓處理并不能使魚糕中內源酶失活，貯藏過程中在內源性酶的作用下魚肉蛋白發(fā)生了降解。在邱春江[15]的研究中發(fā)現，500 MPa的超高壓處理超過10 min時，絲氨酸蛋白酶失活才會受到明顯抑制，而在本試驗中120 s的保壓時間無法達到使內源性酶失活的作用。為進一步說明二氧化氯改善魚糕品質的機制，增加了超高壓與ClO2聯合處理組，處理方式為在二氧化氯涂抹處理之后，進行超高壓處理（500 MPa，120 s），再于 4℃保存。對比超高壓+ClO2處理組與ClO2處理組，這兩組肌球蛋白重鏈并未出現明顯變淺。分析其原因是ClO2在一定程度上對魚肉中內源性酶有失活作用。Benarde等[20]采用快速消毒取樣法，結合分光光度法和同位素示蹤法觀察了ClO2對大腸桿菌的細胞壁和蛋白質合成的影響后指出，用ClO2處理細菌后其細胞內容物（蛋白質和核酸）沒有滲漏出來，說明ClO2沒有破壞細胞壁的完整性，而細胞合成蛋白質的過程卻明顯被抑制，說明二氧化氯對其內源性酶有抑制作用。由于肌球蛋白重鏈的分解是魚蛋白質網狀結構被破壞的重要原因之一。由此可以發(fā)現，ClO2的加入可以使內源性酶失活，有效地保持魚肉的蛋白結構的完整性。

由此證明ClO2處理組延緩持水力、蒸煮損失率和質構特性劣變的主要原因是ClO2處理使內源性酶失活，從而保持了肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的完整性。

2.8 魚糕在貯藏期內的拉曼光譜分析

拉曼光譜是一種振動光譜技術，在分子結構的分析中運用廣泛，是蛋白質構象研究的理想工具。水是很弱的拉曼光譜散射物質，因此無需考慮水分子的振動影響，因此拉曼光譜分析對樣品的物理要求較低。魚糕在貯藏期內拉曼光譜結果見圖8～圖10。

圖8 G組貯藏期內的拉曼光譜圖Fig.8 Raman spectra in the storage period of G group

圖9 UG組貯藏期內的拉曼光譜圖Fig.9 Raman spectra in the storage period of UG group

I850/I830比值大小則可以反映氫鍵結合和酪氨酸側鏈酚羥基的離子化情況。當I850/I830的比值大于1時，表明酪氨酸殘基在蛋白表面是暴露的，可作為氫鍵供體或受體而與溶劑水分子相互作用；當比值為0.7～1時，說明酪氨酸殘基包埋在蛋白分子內部疏水環(huán)境中，可以作為氧鍵供體。由圖8～圖10可得，通過比較I850/I830強度，發(fā)現未處理組從第1天的1.07降至第15天的0.83，同樣超高壓處理組與ClO2處理組都有一定程度的下降，但下降程度較小。說明超高壓處理和ClO2處理可以一定程度抑制酪氨酸殘基的包埋，進而抑制了蛋白疏水性的增加，與持水性和蒸煮損失結果一致。相對于ClO2處理組，超高壓處理組魚糕在貯藏過程中酪氨酸殘基始終暴露于親水微環(huán)境中，只是隨著貯藏時間的延長暴露程度有所降低，說明超高壓可以促進蛋白中新的氫鍵形成，部分酪氨酸殘基可能參與了氫鍵的形成而抑制了其包埋。

C-H 彎曲（1 440 cm-1～1 465 cm-1）峰值向低波長方向的橫移則是由于烴類殘基在蛋白質側鏈上的疏水相互作用[21]。蛋白質使肽鍵主鏈相連接的氨基酸序列組成，其基本組成單位就是酰胺鍵，拉曼光譜中酰胺一帶常被用來分析蛋白質的二級結構[22]。蛋白質的拉曼光譜可以獲取酰胺鍵、碳鏈骨架伸縮振動譜帶，從而得到蛋白質主鏈與側鏈的構像信息，推測蛋白質二級結構的變化。位于1 600 cm-1～1 700 cm-1左右的范圍的酰胺I帶與蛋白質骨架構象類型相關，其主要涉及肽鏈C=O伸縮振動和N-H平面彎曲振動等。α螺旋集中于 1 650 cm-1～1 658 cm-1，β 折疊集中于 1 610 cm-1～1 640 cm-1，β 轉角集中于 1 660 cm-1～1 700 cm-1，無規(guī)則卷曲集中于 1 640 cm-1～1 650 cm-1。

魚糕二級結構含量由圖11所示。

圖11 貯藏過程中鰱魚魚糕二級結構相對含量Fig.11 Relative content of secondary structure of the Kamaboko gels during storage

研究表明新鮮魚肉中α螺旋含量較高[15]，但從魚糕二級結構來看，α螺旋與β折疊的含量都相對較低，說明二級結構偏向于無序化，這與其加工處理過程中的熱處理有關[23]。從圖11中，對比未處理組與超高壓處理組，超高壓處理組α螺旋和β折疊的相對含量更高，說明超高壓處理組的有序化程度更高，這可能是由于超高壓處理形成了新的氫鍵所致。由此可以解釋在TPA指標，如硬度、彈性等超高壓處理組較高的原因。而對比未處理組，ClO2處理組的二級結構與G組并無明顯差異，說明ClO2處理組持水性、蒸煮損失等指標更有的原因主要在于其對蛋白亞基組分降解的抑制。

3 結論

1）魚糕經過500 MPa，120 s超高壓和10 mg/L ClO2處理后，保質期可以顯著提高，冷藏19 d仍未超過國家相應標準，這主要是因為兩種處理對微生物的抑制作用，相對而言超高壓處理保鮮效果更優(yōu)。

2）超高壓和ClO2處理均能夠提高魚糕的持水性，降低魚糕的蒸煮損失，改善魚糕的質構品質，其中超高壓處理后，魚糕的質構指標改善更加明顯。

3）除了對微生物的抑制外，兩種處理對于魚糕品質的改善機制有所不同，超高壓處理后魚糕蛋白分子間可以形成新的氫鍵，且結構較無處理組更加有序，進而使魚糕的品質得到改善；ClO2處理改善魚糕品質的原因則主要在于其對魚糕中內源酶的抑制。