達(dá)比加群酯磷脂復(fù)合物納米乳的制備及體外評(píng)價(jià)

劉曉慶，鄭春麗，張雅捷，何新怡，柴夫娟，陳 敏

(1.上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院藥劑科，上海 201318；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009)

達(dá)比加群酯(dabigatran etexilate，DE)是一種新型的直接凝血酶抑制劑，是達(dá)比加群的前藥，主要用于預(yù)防非瓣膜性房顫患者的卒中和全身性栓塞[1-2]。DE水溶性差，滲透性良好，是生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)BCS Ⅱ類藥物[3-4]，由于生物利用度差，臨床應(yīng)用受限[5-6]。

納米乳給藥體系作為提高難溶性藥物口服生物利用度的理想載體是目前研究的熱點(diǎn)[7-10]，本研究將DE制成達(dá)比加群酯磷脂復(fù)合物(dabigatran etexilate phosphlipid complex，DE-PC)，并將其包封于納米乳中制成DE-PC納米乳，以期結(jié)合磷脂復(fù)合物和納米乳的優(yōu)點(diǎn)提高DE的口服生物利用度[11-14]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UV-2102 PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)；ZETA SIZER 3000 H SA粒徑儀(英國(guó)MALVERN公司)；JY 92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；3K30冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；DZF-6020臺(tái)式真空干燥箱(鎮(zhèn)江市科學(xué)儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 達(dá)比加群酯(上海譜振生物科技有限公司，含量99.8%，批號(hào)20130915)；卵磷脂(PC，德國(guó)Lipoid，上海東尚生物科技有限公司)；乙二醇單乙基醚,中鏈脂肪酸甘油酯(MCT，LabrafacTMLipophile WL1394)，法國(guó)GAITEFOSSE公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油(Cremophor?RH40，德國(guó)BASF公司)；葡聚糖凝膠(G-50，上海金穗生物科技有限公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1DE-PC納米乳的制備

2.1.1DE-PC的制備 精密稱取處方量(DE-卵磷脂=1∶1.5，質(zhì)量比)的DE和卵磷脂，置于圓底燒瓶中，加入適量二氯甲烷，使DE的質(zhì)量濃度為25 mg·mL-1。水浴(30 ℃)反應(yīng)3 h后，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷。將收集到的產(chǎn)物再用乙腈溶解，抽濾后收集濾液并減壓旋蒸，真空干燥24 h，得DE-PC。

2.1.2三元相圖的繪制 根據(jù)前期研究[15]，選擇以1∶1質(zhì)量比例混合的油酸和中鏈脂肪酸三酰甘油(MCT)為油相。以聚氧乙烯氫化蓖麻油為乳化劑，乙二醇單乙基醚為助乳化劑，乳化劑和助乳化劑的質(zhì)量比Km為2∶1，得混合物(Smix)，與油相按照1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1的比例混勻，固定總質(zhì)量為1 g，加入DE-PC 25 mg，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胝麴s水，以形成澄清透明或半透明的帶淡藍(lán)色乳光的溶液作為納米乳形成的臨界點(diǎn)，記錄臨界點(diǎn)時(shí)各組分的百分比。以Smix、油相和水分別作為3個(gè)頂點(diǎn)，3條邊各為相應(yīng)兩組分的比例關(guān)系，繪制三元相圖。

2.1.3制備工藝單因素考察 選擇油酸-中鏈脂肪酸甘油酯(混合比為1∶1)為油相，聚氧乙烯氫化蓖麻油為乳化劑、乙二醇單乙基醚為助乳化劑，油相、乳化劑、助乳化劑和水的質(zhì)量比為2∶2∶1∶15，加入處方量DE-PC于上述油相、乳化劑和助乳化劑的混合物中，超聲溶解并混勻，磁力攪拌下逐滴加入恒溫水相中進(jìn)行乳化，得初乳，進(jìn)一步探頭超聲得到納米乳。以粒徑和多分散系數(shù)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)制備過(guò)程中的攪拌速度、攪拌時(shí)間、乳化溫度以及探頭超聲時(shí)間進(jìn)行單因素考察。

2.1.4制備工藝的正交優(yōu)化 根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇攪拌速度、乳化溫度和探頭超聲時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[16-17]，各因素取3個(gè)水平，因素和水平見(jiàn)表1。以納米乳的外觀、離心穩(wěn)定性和粒徑作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，然后將各指標(biāo)得分相加得總分，以3項(xiàng)總分作為綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①外觀：澄清、透明、藍(lán)色乳光明顯、均一、稀薄為5分，一項(xiàng)不滿足減1分；②離心穩(wěn)定性：以12 000 r·min-1離心15 min，不分層無(wú)藥物析出為5分；不分層但有極少藥物析出為4分；不分層有少部分藥物沉積為3分；不分層有較多藥物沉積為2分；分層且大部分藥物沉積為1分；③粒徑：平均粒徑在50 nm內(nèi)為5分；在50～100 nm為4分;在100～150 nm為3分；150～200 nm為2分；200 nm以上為1分。

2.2DE-PC納米乳理化性質(zhì)

2.2.1粒徑與電位 按照最佳處方工藝制備DE-PC納米乳，用蒸餾水稀釋100倍，以激光粒徑儀測(cè)定粒徑和Zeta電位，各樣品測(cè)定3次。

表1正交設(shè)計(jì)因素與水平

Tab.1 Factors and levels of the orthogonal design

水平因素A,乳化溫度/℃B,攪拌速度/r·min-1C,超聲時(shí)間/s1251004823720096350300120

2.2.2包封率的測(cè)定 按照最佳處方工藝制備DE-PC納米乳，將DE-PC納米乳0.2 mL加于預(yù)先制備的葡聚糖凝膠微柱上端，將微柱置于10 mL離心管中,以2 500 r·min-1離心5 min，取出，繼續(xù)加蒸餾水0.2 mL，再以2 500 r·min-1離心5 min，收集離心管中微柱洗脫下來(lái)的帶乳光部分，用無(wú)水乙醇破乳后測(cè)DE的含量，計(jì)算包封率[18-19]。

包封率=收集得到的帶乳光部分的藥物含量÷納米乳中藥物的含量×100%

2.3DE-PC納米乳的穩(wěn)定性考察

2.3.1穩(wěn)定性常數(shù)測(cè)定 取3份DE-PC納米乳5 mL置于離心管中，以4 000 r·min-1離心15 min，刺破管底，收集1 mL，取收集液和離心前納米乳各100 μL,置于10 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，于500 nm處測(cè)定離心前后的吸光度值A(chǔ)0和A，按照下式計(jì)算穩(wěn)定性常數(shù)Ke[20]。

四氫呋喃用量和提取溫度對(duì)葉黃素提取量影響的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖5。如圖5所示，固定KOH甲醇溶液質(zhì)量濃度為0.1g/mL，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，稻谷中葉黃素提取量隨四氫呋喃用量的增加而增加，到達(dá)峰值后，葉黃素提取量緩慢下降；當(dāng)四氫呋喃用量不變時(shí)，提取量隨溫度的上升而增加，在溫度到達(dá)50℃后，葉黃素提取量隨溫度上升而逐漸下降。

Ke=(A0-A)÷A0×100%

2.3.2離心穩(wěn)定性考察 取3份DE-PC納米乳5 mL，置于離心管中，分別以4 000，8 000和12 000 r·min-1離心30 min，觀察是否有分層和藥物析出。

2.3.3稀釋穩(wěn)定性考察 取DE-PC納米乳適量，加入37 ℃的蒸餾水，分別將其稀釋10，50，100，200和500倍，并用激光粒度儀測(cè)定粒徑，考察稀釋倍數(shù)對(duì)DE-PC納米乳的粒徑的影響。取DE-PC納米乳適量，分別以pH值為1.2，2.0和3.0 的鹽酸溶液及pH值為4.0和6.86的磷酸緩沖液、蒸餾水為稀釋介質(zhì)，將DE-PC納米乳稀釋100倍測(cè)定粒徑，考察稀釋介質(zhì)對(duì)DE-PC納米乳的粒徑的影響。

2.3.4影響穩(wěn)定性的因素考察 取適量DE-PC納米乳，密封于西林瓶中，分別置于室溫(25 ℃)、40 ℃和強(qiáng)光(4 500 lx)條件下。室溫放置的DE-PC納米乳分別于第30和90天取樣，高溫和強(qiáng)光下放置的DE-PC納米乳分別于第5天和10天取樣，測(cè)定粒徑、DE含量和穩(wěn)定常數(shù)，與第0 天時(shí)進(jìn)行比較。其中，DE含量的測(cè)定采用UV法，于315 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1DE-PC納米乳的制備

3.1.1載DE-PC三元相圖的繪制 在前期研究的基礎(chǔ)上[15]，對(duì)篩選出的油相、乳化劑和助乳化劑系統(tǒng)進(jìn)行載DE-PC的三元相圖的繪制，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，與空白納米乳體系相比，DE-PC納米乳的三元相圖的乳化區(qū)域面積有所增大，說(shuō)明載藥后的DE-PC納米乳體系的穩(wěn)定性良好。

圖1載DE-PC納米乳的三元相圖

Fig.1 Ternary phase diagram of the nanoemulsion after drug loading

3.1.2DE-PC納米乳制備工藝單因素考察

3.1.2.1磁力攪拌時(shí)間 攪拌時(shí)間對(duì)DE-PC納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，其粒徑和多分散系數(shù)先變小后逐漸增大。可能的原因是攪拌力可分散納米乳滴，但攪拌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加納米乳滴之間的碰撞，產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，使粒徑和多分散系數(shù)增大。故將攪拌時(shí)間定為10 min。

圖2攪拌時(shí)間對(duì)DE-PC納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響

Fig.2 Effects of stirring time on particle size and PDI (n=3)

圖3攪拌速度對(duì)DE-PC納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響

Fig.3 Effects of stirring speed on particle size and PDI (n=3)

3.1.2.3乳化溫度 乳化溫度對(duì)DE-PC納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著乳化溫度的增大，其粒徑和多分散系數(shù)逐漸變小，在37 ℃下最?。焕^續(xù)升高溫度，其粒徑和多分散系數(shù)又逐漸增大。可見(jiàn)乳化溫度對(duì)納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響較大，故需對(duì)乳化溫度進(jìn)行后續(xù)考察。

圖4乳化溫度對(duì)DE-PC納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響

Fig.4 Effects of stirring temperature on particle size and PDI (n=3)

3.1.2.4探頭超聲時(shí)間 探頭超聲時(shí)間對(duì)DE-PC 納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著探頭超聲時(shí)間增加，納米乳的粒徑和多分散系數(shù)先減小后增大，在96 s時(shí)最小。原因可能為，隨著探頭超聲時(shí)間的增加，外界機(jī)械力在分散納米乳滴的同時(shí)，增加了納米乳滴之間的碰撞次數(shù)，產(chǎn)生乳滴聚集。可見(jiàn)探頭超聲時(shí)間對(duì)納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響較大，故需對(duì)探頭超聲時(shí)間進(jìn)行后續(xù)考察。

3.1.3DE-PC納米乳制備工藝的正交優(yōu)化 DE-PC納米乳制備工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，3個(gè)因素對(duì)納米乳粒徑和穩(wěn)定性的影響順序?yàn)椋喝榛瘻囟?超聲時(shí)間>攪拌速度。由方差分析結(jié)果可知，乳化溫度對(duì)粒徑和穩(wěn)定性有顯著影響。最佳制備工藝為A2B2C2。具體制備步驟：取處方量的油酸、聚氧乙烯氫化蓖麻油和乙二醇單乙基醚，置于西林瓶中，磁力攪拌均勻后，加入處方量的DE-PC復(fù)合物，超聲溶解后，磁力攪拌均勻，在200 r·min-1磁力攪拌下逐滴加入37 ℃的水相中，攪拌10 min后再用探頭超聲96 s，即得。

圖5探頭超聲時(shí)間對(duì)DE-PC納米乳粒徑和多分散系數(shù)的影響

Fig.5 Effects of ultrasonic time on particle size and PDI (n=3)

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of the orthogonal design

編號(hào)ABC外觀穩(wěn)定性粒徑得分111133392122444123133342942124551452234431162313328731312258321231693322226K110.009.337.67K211.009.6710.68K35.677.678.33R5.332.003.00PP<0.050.05

3.2DE-PC納米乳的理化性質(zhì)表征

3.2.1DE-PC納米乳粒徑與電位 粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，DE-PC納米乳的平均粒徑為79.4±1.1 nm，多分散系數(shù)為0.172±0.009，說(shuō)明納米乳的粒徑較小，且粒度分布較均勻。電位測(cè)定結(jié)果表明，DE-PC納米乳的電位為-(22.1±0.8) mV，表明納米乳體系穩(wěn)定，不易發(fā)生粒子聚集現(xiàn)象。

3.2.2DE-PC納米乳包封率 結(jié)果顯示，DE-PC納米乳對(duì)DE的包封率達(dá)到93.7%±1.2%。因此，在DE-PC納米乳中，絕大部分藥物被包封在內(nèi)部油相，這對(duì)提高納米乳中藥物的穩(wěn)定性和促進(jìn)藥物的吸收有著重要的作用。

3.3DE-PC納米乳的穩(wěn)定性

3.3.1穩(wěn)定常數(shù)測(cè)定 結(jié)果表明，DE-PC納米乳的穩(wěn)定常數(shù)Ke為15.42%±1.10%，表明其穩(wěn)定性較好。

3.3.2離心穩(wěn)定性 DE-PC納米乳在分別以4 000，8 000和12 000 r·min-1離心30 min后均無(wú)分層和藥物析出現(xiàn)象，說(shuō)明DE-PC納米乳體系穩(wěn)定性良好。

3.3.3稀釋穩(wěn)定性 不同倍數(shù)蒸餾水稀釋對(duì)DE-PC納米乳的粒徑的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，其對(duì)DE-PC納米乳的粒徑和多分散系數(shù)影響均不明顯。不同稀釋介質(zhì)對(duì)DE-PC納米乳的粒徑的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知，其對(duì)DE-PC納米乳的粒徑和多分散系數(shù)的影響亦不顯著，說(shuō)明DE-PC納米乳稀釋穩(wěn)定性良好。

圖6稀釋倍數(shù)對(duì)DE-PC納米乳粒徑的影響

Fig.6 Effects of dilution multiple on particle size and PDI (n=3)

圖7稀釋介質(zhì)對(duì)DE-PC納米乳粒徑的影響

Fig.7 Effects of dilution media on particle size and PDI (n=3)

3.3.4影響穩(wěn)定性的因素 見(jiàn)表3。由表3可知，DE-PC納米乳在室溫25 ℃保存時(shí)，其外觀、粒徑、穩(wěn)定性常數(shù)和藥物含量在90 d內(nèi)基本保持不變，說(shuō)明DE-PC納米乳在室溫條件下可以較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定。然而，在40 ℃和強(qiáng)光條件下，DE-PC納米乳均在第10天出現(xiàn)了粒徑增大、穩(wěn)定性常數(shù)變大和DE含量下降，穩(wěn)定性減弱。因此，為盡量避免DE的析出和降解，DE-PC納米乳應(yīng)在室溫避光條件下儲(chǔ)存。

表3影響DE-PC納米乳穩(wěn)定性的因素

Tab.3 The fators of stability of DE-PC nanoemulsion(n=3)

影響因素時(shí)間/d粒徑/nmKe/%含量/%40 ℃079.5±0.216.92±1.0199.56±0.15582.9±0.521.05±2.1498.91±1.001089.4±0.734.70±2.2296.51±1.234 500 lx584.1±0.424.51±2.3098.12±0.841092.3±0.735.10±2.4695.78±0.9125 ℃3080.1±1.017.57±1.6399.61±0.079082.0±0.319.60±1.7898.50±0.50

4 討論

通過(guò)單因素考察和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了DE-PC納米乳的制備工藝，DE-PC納米乳的粒徑和穩(wěn)定性受乳化溫度影響較為顯著。優(yōu)化后的制備工藝為乳化溫度37 ℃，攪拌速度200 r·min-1，探頭超聲96 s；所得DE-PC納米乳的粒徑在100 nm以內(nèi)，且粒度分布均勻，包封率高，稀釋穩(wěn)定性和離心穩(wěn)定性均良好。室溫放置3個(gè)月的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備DE-PC納米乳的粒徑、穩(wěn)定常數(shù)和藥物含量均未發(fā)生顯著變化，因而制劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。

本研究將低水溶性、高滲透性藥物DE成功制成粒徑均一、穩(wěn)定的DE-PC納米乳，以期利用磷脂復(fù)合物和納米乳的雙重優(yōu)點(diǎn)提高DE的口服生物利用度，為提高同類藥物生物利用度的研究提供參考。在后續(xù)研究中，將對(duì)DE-PC納米乳的動(dòng)物體內(nèi)吸收和生物利用度作進(jìn)一步研究。