氣滯胃痛顆粒中柴胡的質(zhì)量控制方法研究

程似錦 ，李 恒 ，晏菊姣 △

（1．長江職業(yè)學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)院，湖北 武漢 430064； 2．武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430075）

氣滯胃痛顆粒為柴胡、延胡索(炙)、枳殼、香附(炙)、白芍、炙甘草6味藥材組方的中藥制劑，主要用于治療胃炎、反流性胃炎、腸易激綜合征等[1－2]。方中柴胡功用為調(diào)達(dá)肝氣、舒理氣滯，是本制劑中治“氣滯”的主藥[2]，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有對柴胡的控制指標(biāo)。本研究中參照文獻(xiàn)[3－7]，選擇柴胡對照藥材、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d對照品為指標(biāo)，對柴胡建立薄層色譜或高效液相色譜鑒別方法，并探討柴胡皂苷b2作為表征方中柴胡指標(biāo)的可能性。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Camag TLC Visualizer薄層色譜照相儀，U3000型液相色譜儀（DAD檢測器，美國Dionex公司）；BP211D型電子 天 平 （賽 多 利 斯 公司，感 量 為 0．1 ／0．01 mg）；SK250LHC型超聲清洗儀；DK－S26型電熱恒溫水浴鍋；Simplicity超純水機(jī)；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）。

1．2 試藥

氣滯胃痛顆粒（有糖型或無糖型，遼寧本溪三藥有限公司）；柴胡皂苷a對照品（批號為110777－201108），柴胡皂苷d對照品（批號為110778－200404），柴胡對照藥材（批號為120992－201108），均購于中國食品藥品檢定研究院；柴胡皂苷b2對照品（批號為51／120507），柴胡皂苷c對照品（批號為51／120507）均購于Shanghai Standard Biotech Co，Ltd．。乙腈為色譜純；甲醇，正丁醇，氫氧化鈉，氨水，對二甲氨基苯甲醛，硫酸均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液制備

供試品溶液：取氣滯胃痛顆粒 15 g或 7 g（無糖型），研細(xì)，加甲醇 50 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，以2%氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次30 mL，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得。

陰性對照品溶液:取缺柴胡藥材的其他藥味，按處方比例制成缺柴胡陰性樣品，再按供試品溶液方法制備，即得。

對照品溶液：取柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的混合溶液，即得。

對照藥材溶液：取柴胡對照藥材0．5 g，加水煎煮1 h，濾過，濾液濃縮至約20 mL，自“用水飽和的正丁醇振搖提取3次”起同供試品溶液方法制備，即得對照藥材溶液Ⅰ。照2015年版《中國藥典(一部)》柴胡項(xiàng)下含量測定方法[8]，取柴胡對照藥材 0．5 g，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）30 min，濾過，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾過合并，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得對照藥材溶液Ⅱ。

2．2 薄層色譜法

按 2015年版《中國藥典(四部)》通則[9]試驗(yàn)，吸取上述除對照藥材溶液Ⅱ的4種溶液各2～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以乙酸乙酯－乙醇－水（8∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與柴胡皂苷b2對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，在與柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d對照品溶液色譜相應(yīng)位置上未顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，陰性對照品（缺柴胡）溶液色譜相應(yīng)位置無干擾，分離度良好。見圖1。

2．3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2．3．1 薄層色譜驗(yàn)證

分別吸取供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液Ⅰ和Ⅱ4種溶液，照2．2項(xiàng)下方法試驗(yàn)。對照藥材溶液Ⅱ色譜可檢出柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，但未見柴胡皂苷b2斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)；對照藥材溶液Ⅰ色譜柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d斑點(diǎn)顏色變淡，同時(shí)新出現(xiàn)了柴胡皂苷b2的斑點(diǎn)。見圖2。

2．3．2 高效液相色譜驗(yàn)證

溶液制備：按本品水煎煮提取工藝模擬投料的自制小樣，照2．1項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

圖1 鑒別薄層色譜圖

圖2 驗(yàn)證薄層色譜圖

色譜條件及與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱為戴安Acclaim 120 C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈(A)－水(B)，梯度洗脫(表1)；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。同時(shí)，采用DAD進(jìn)行檢測。理論板數(shù)按柴胡皂苷a峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

表1 流動相梯度洗脫表

測定與結(jié)果：照2015年版《中國藥典(四部)》通則中高效液相色譜法[8]測定。分別精密吸取2．1．1項(xiàng)下供試品溶液，對照品溶液、對照藥材溶液Ⅰ及2．3．2項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，呈現(xiàn)與柴胡皂苷b2對照品色譜峰保留時(shí)間相的色譜峰，未呈現(xiàn)與柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d對照品色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰。

圖3 驗(yàn)證高效液相色譜圖

3 討論

圖2顯示，本次收集到的多批柴胡藥材及來源于中國食品藥品檢定研究院的柴胡對照藥材經(jīng)水煎煮后，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d斑點(diǎn)顏色變淡，同時(shí)新出現(xiàn)柴胡皂苷b2的斑點(diǎn)，而成品中僅檢視出柴胡皂苷b2的斑點(diǎn)。

圖3表明，柴胡藥材甲醇提取，均有柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d成分；但柴胡藥材經(jīng)水煎煮后，其成分發(fā)生變化，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d減少，產(chǎn)生柴胡皂苷b2。氣滯胃痛顆粒各藥材混合煎煮后提取的自制樣品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d幾乎完全消失。

柴胡皂苷a、柴胡皂苷d會隨水煎煮時(shí)間的延長而減少，柴胡皂苷d甚至完全消失；柴胡皂苷a、柴胡皂苷d在受熱或酸性條件下也會轉(zhuǎn)化為與之對應(yīng)的柴胡次級皂苷 b1，b2[10－13]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同。柴胡皂苷b2也是柴胡發(fā)揮藥效的有效成分[14－16]，從柴胡的用藥歷史上看，多數(shù)情況下是與其他藥共煎入藥，也就是說柴胡是通過其次生皂苷發(fā)揮藥效。

綜上所述，柴胡藥材按照本品種的工藝進(jìn)行水煎煮提取后，相關(guān)柴胡皂苷會消失或轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生柴胡皂苷b2。綜合本制劑的制法、有關(guān)文獻(xiàn)資料和模擬試驗(yàn)結(jié)果，選取柴胡皂苷b2作為表征方中柴胡的特征是可行和有意義的。同時(shí)，該方法也為含柴胡藥味經(jīng)水煎煮的同類制劑中柴胡藥材的鑒別提供了參考依據(jù)。