口蹄疫疫苗的研究進展

孫 瑩 孫曉軍 包世俊*

1.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州730070；2.甘肅省蘭州市動物疫病預防控制中心，蘭州730050

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，俗稱“口瘡”。該病易感動物為家養(yǎng)或野生偶蹄動物，多達70 種。發(fā)病動物主要臨床表現(xiàn)為唇內面、齒齦、舌面、臉頰部黏膜、四肢下端及乳房處等無毛部位形成水皰，水皰破潰后形成紅色潰爛，嚴重病例蹄殼脫落，引發(fā)動物跛行。成年發(fā)病動物，生產性能降低，如種畜失去種用價值，奶畜產奶受到影響。幼齡動物感染后可導致出血性腸炎和心肌炎，常因心肌麻痹而猝死，病死率高達100%[1]。由于該病潛伏期短、發(fā)病率高（50%～100%）、傳播迅速，一旦出現(xiàn)疫情，極易發(fā)生大范圍的流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失[2]。

FMDV 屬于微RNA 病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），病毒粒子是由單股線狀正鏈RNA和包圍其外的衣殼蛋白兩部分組成，是目前已知動物病毒中最小病毒之一[3]?？谔阋咄谎逍偷亩局昕乖砸泊嬖诓町悾總€型可根據結構蛋白VP1 的核苷酸序列差異可分為拓撲型，進一步可將拓撲型分為不同譜系。FMDV 易發(fā)生變異，進一步增加了疫苗毒株篩選的難度，從而給FMD 的防控帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。隨著生命科學領域不斷取得新的突破，現(xiàn)代生物技術的發(fā)展亦突飛猛進，并在新型疫苗的研發(fā)中被廣泛應用，從而為高效、安全、穩(wěn)定的新型口蹄疫疫苗的研發(fā)提供了技術保障。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 弱毒疫苗

弱毒疫苗是由豚鼠，乳鼠，雞胚，連續(xù)細胞傳代或對口蹄疫原始株的人工誘變獲得的人工減毒株和減毒株。大量擴增后，加入一定劑量的保護劑和佐劑。它是一種成本低廉，使用方法簡單的病毒制[4]。1960－1980年，云南省瀾滄江以西地區(qū)面對AsiaⅠ型口蹄疫采用中國保山型（ZB 型）致弱毒株進行免疫防治[5]。在3～5日齡乳兔體內傳代109代，回歸牛體毒力減弱，致病力和免疫原性均達到口蹄疫弱毒疫苗標準，免疫保護效果良好，且免疫持續(xù)期達半年以上。但是，由于新的毒株不斷出現(xiàn)，毒株的致弱結果和致弱時間不能確定，在假定宿主中致弱的毒株，會對其他易感動物具有強致病性，甚至存在與流行毒株重組、毒力返祖和回復突變的潛在風險，以及活毒株持續(xù)感染、妨礙疫源凈化等缺點，現(xiàn)兔化弱毒疫苗株ZBatt 已停用，逐漸被其他類型疫苗所取代[6]。

1.2 滅活疫苗

滅活疫苗主要包括口蹄疫O 型滅活苗及口蹄疫O 型、A 型二價滅活苗兩大類。該類疫苗是通過懸浮培養(yǎng)傳代細胞、病毒抗原濃縮純化、滅活乳化等生產工藝進行生產。近年來，隨著生產工藝的不斷提高，滅活疫苗質量顯著提升[7]?？谔阋邷缁钜呙缟a需要高標準的生物安全設施和嚴格的操作規(guī)程，可能存在強毒滅活不徹底的風險和多次免疫接種動物后產生非結構蛋白抗體影響感染與免疫鑒別等。因此，研制能區(qū)分感染與免疫的標記疫苗、亞單位疫苗等新型基因工程疫苗是目前研究的熱點[8-9]。目前，F(xiàn)MD 免疫接種主要使用口蹄疫滅活疫苗，其安全性高，免疫效果好，在FMD的防控中發(fā)揮了重要作用，A 型顯著減少，O 型零星散發(fā)，社會效益顯著。

2 生物技術疫苗

2.1 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是以病毒（痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、慢病毒）或細菌作為載體，將外源基因插入載體基因組的非必需區(qū)內，通過轉染細胞，隨載體增殖，使得外源基因得到高效表達，再將表達產物純化用于免疫[10]。同時，載體本身也會起到佐劑作用，刺激動物機體的細胞免疫。劉新生[11]構建乳酸桿菌載體口蹄疫VP1基因DNA 疫苗，使小鼠和豬體內均產生特異性細胞免疫和體液免疫。

2.2 基因工程亞單位疫苗

利用DNA 重組技術，將編碼FMDV 的保護性抗原基因導入原核或真核細胞，以獲得重組免疫保護蛋白作為抗原制成的疫苗，免疫動物后，動物體內會產生中和抗體，提高機體抵抗力。由于免疫原單一，也有效解決了傳統(tǒng)疫苗免疫抑制的問題。FM?DV 基因工程亞單位疫苗主要利用各種表達系統(tǒng)包括大腸桿菌、枯草桿菌等表達系統(tǒng)表達VP1 蛋白，但該蛋白在原核表達系統(tǒng)中通常會出現(xiàn)無法正確加工和折疊等問題，通過用酵母、桿狀病毒等表達系統(tǒng)表達VP1 蛋白制成疫苗，則提高了疫苗的免疫原性，有效克服以上不足。基因工程亞單位疫苗安全價廉，便于大規(guī)模生產，目前應用較多。

2.3 基因缺失/標記疫苗

基因缺失疫苗是利用基因工程技術去除與病原體毒力有關的基因，獲得毒力喪失或降低的毒株，但不影響免疫原性，又稱標記疫苗，免疫效果好，安全、遺傳性能更穩(wěn)定，毒力不返祖[12]。缺失的基因還可作為一種遺傳標志，用于建立鑒別診斷方法，有研究證實含缺失3A 蛋白aa109～aa115 位（B細胞表位）編碼區(qū)的FMDV 是可用于鑒別診斷的FMD標記疫苗[13]。

2.4 合成肽疫苗

FMDV的主要保護多肽是通過化學合成或基因工程人工合成的，并連接到大分子載體上，可以根據流行株的情況調整用適當佐劑制成的疫苗。由于合成肽疫苗的免疫效力不如常規(guī)滅活疫苗，目前，合成肽疫苗在豬口蹄疫的預防與防控中較常用。

2.5 基因疫苗

包括DNA 疫苗、RNA 疫苗，是指由編碼能引起保護性免疫反應的病原體抗原的基因片段和載體構建而成，將其直接導入動物體內，通過宿主細胞轉錄表達系統(tǒng)合成目標抗原蛋白，誘導宿主對該抗原蛋白產生免疫應答，達到預防和治療疫病的目的?；蛞呙缇哂休^強的熱穩(wěn)定性，因而便于貯存和運輸。

2.6 反向遺傳疫苗

如今，由于反向遺傳技術不斷發(fā)展，使得通過對FMDV 的靶基因進行改造和修飾，如替換、突變、插入或敲除FMDV 部分基因等方法制成的疫苗，免疫動物同樣能達到較好的免疫效果。FMDV反向遺傳疫苗的研制為開發(fā)新型疫苗開辟了新方向，表位互補疊加，拓寬了抗原譜，組合優(yōu)勢毒株，免疫效力大大提高，免疫保護期延長，提高了生物安全性，在疫苗研發(fā)方面取得了突破。

2.7 轉基因植物可飼疫苗

隨著轉基因技術的不斷發(fā)展，F(xiàn)MDV 可飼疫苗的研究也取得了重大突破?？娠曇呙缡峭ㄟ^把植物基因工程技術與機體免疫機理相結合，將抗原基因導入植物細胞中，形成轉基因植物，利用植物作為生物反應器大量表達外源蛋白作為疫苗，或將轉基因植物直接加工飼喂動物使其獲得免疫，是當前新型疫苗研究的熱點之一。除此之外，可飼疫苗還常以苜蓿、番茄、馬鈴薯等為表達體系，使用安全性高，成本較低，免疫方法簡便，為生產動物疫苗提供新思路，但由于動物個體的攝入量不同，免疫效果不易保障，仍需進行深入研究。

2.8 表位疫苗

表位疫苗是通過基因工程技術人工合成病原微生物的抗原表位，與T 細胞表面受體（TCR）、B 細胞表面受體（BCR）或抗體分子特異性結合，引起特異性免疫應答，誘導動物機體產生體液及細胞免疫應答[14]。利用不同血清型的抗原表位的組合，制備多價疫苗，對不同血清型的FMDV 侵襲形成保護。由于多表位疫苗具有廣譜表位信息，可避免由于病毒變異導致免疫失敗。現(xiàn)階段，病毒樣顆粒、蛋白分子、脂質分子均是理想的表位疫苗載體，乙型肝炎核心病毒抗原（HBcAg）是目前最具潛力的表位疫苗病毒樣粒子載體[15]。HBcAg 有3 個區(qū)域：N 端、C 端、MIR 區(qū)均可插入外源基因。通過在MIR 區(qū)第75～78 位氨基酸、75～80 位氨基酸和75～82 位氨基酸插入FMDV 的多表位的不同組合，構成病毒樣粒子，在體內外均能被吞噬細胞吞噬，并能提高特異性抗體表達水平，顯著提高淋巴細胞的增殖能力。由此可見，表位疫苗具有廣闊研究前景。

3 結 語

自口蹄疫疫苗問世70余年來，免疫接種仍舊是世界上許多國家和地區(qū)預防控制口蹄疫的主要途徑。本綜述了國內外口蹄疫疫苗的研究情況，為未來探索研究口蹄疫新型疫苗提供參考。