藤梨根皮部與木部的顯微鑒定及其多糖中單糖的構(gòu)成分析

王亞瓊，張華鋒，汪映宇，鐘水生，周 堅(jiān)

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215104)

歷代本草記載藤梨根為獼猴桃科(Actinidiaceae)植物中華獼猴桃ActinidiachinensisPlanch.的干燥根，秋季采挖，切片，曬干[1-3]。市場(chǎng)上藤梨根的商品藥材多以木部為主，且目前尚無典型的化學(xué)成分可作為液相或氣相的質(zhì)量控制依據(jù)。近年來，有關(guān)天然藥物中多糖的藥物活性及其作用機(jī)制研究成為研究熱點(diǎn)[4-5]。多糖是藤梨根中的重要抗腫瘤成分，對(duì)其提取、分離及藥理藥效的研究也逐漸受到研究者們的重視[6-8]。將現(xiàn)有不同的分析技術(shù)用于糖的分離和測(cè)定，包括化學(xué)分析、比色分析、紙色譜、TLC法和HPLC法等[9-20]。考慮用HPLC法測(cè)定糖的定性和定量分析具有快速、靈敏、樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)先采用顯微鑒別法區(qū)別藤梨根原根的不同部位，再用柱前衍生HPLC法分析藤梨根不同部位多糖水解產(chǎn)物中的單糖組分，為藤梨根藥用部位的正確使用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DFY-300粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)藥篩(遼寧省遼陽金屬制品廠)；XMTD-204電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；Agilent 1260 高效液相色譜儀，配VWD檢測(cè)器，ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，美國(guó)安捷倫公司；Sorvall ST 8 臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；AG245電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；FD240烘箱(德國(guó)Binder公司)；CM1860冰凍切片機(jī)，DM2000顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)。

1.2試藥 3批藤梨根原藥材分別采自安徽大別山、福建寧德和南京六合，其余3批藥材飲片購自藥材市場(chǎng)，均由蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心吳銀生主任中藥師鑒定為中華獼猴桃ActinidiachinensisPlanch.的干燥根；D-無水葡萄糖(批號(hào)110833-201205)、鹽酸氨基葡萄糖(批號(hào)140649-201304)和甘露糖(批號(hào)140651-201403)，均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；阿拉伯糖、半乳糖及巖藻糖(Sigma-Aldrich公司)；無水乙醇、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)和氫氧化鈉均為分析純，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸(TFA，美國(guó)天地有限公司)；超純水(美國(guó)Millpore公司)。

2 藤梨根原根橫切面顯微鑒別

取原根泡水軟化后，冰凍切片機(jī)切片，水合氯醛透化后，置于顯微鏡下觀察可見：木栓層細(xì)胞數(shù)列至10余列，其間有石細(xì)胞分布，單個(gè)散在或2～4個(gè)切向排列。栓內(nèi)層狹窄，韌皮部細(xì)胞多含紅棕色的色素塊；黏液細(xì)胞含大量草酸鈣針晶。形成層不明顯。木質(zhì)部寬廣；導(dǎo)管直徑較大，多單個(gè)散在；射線細(xì)胞1～5列，徑向延長(zhǎng)。見圖1。

圖1藤梨根原根橫切面(×100)

）1.木栓層；2.石細(xì)胞；3.草酸鈣針晶；4.韌皮部；5.木質(zhì)部；6.導(dǎo)管。

Fig.1 Crude root cross-section of RadixActinidiaechinensis(×100)

）1.cork layer；2.stone cell；3.needle-like calcium oxalate crystals；4.phloem；5.xylem；6.vessel.

3 多糖中單糖的分析

3.1多糖供試品溶液的制備 取供試藥材細(xì)粉2 g，精密稱定，加超純水60 mL，沸水浴熱回流3 h，放冷，以3 500 r·min-1離心5 min，精密量取上清液3 mL，置于15 mL離心管中，精密加入無水乙醇9 mL，搖勻，4 ℃冷藏過夜，取出，以3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，沉淀加1.5 mL水溶解，搖勻，即得。

3.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制 取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成質(zhì)量濃度為12 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

3.3衍生化 取多糖供試品溶液1 mL，加入3.2項(xiàng)下制備的內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，置于頂空瓶中，加TFA，封口，混勻，110 ℃水解，放冷，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，吸取400 μL，加0.5 mo1·L-1的PMP甲醇溶液與0.3 mol·L-1的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)。再加入0.3 mo1·L-1的鹽酸溶液500 μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2 mL，棄去三氯甲烷液，水層離心為衍生化的樣品溶液。

3.4色譜條件 以乙腈-0.02 mol·L-1的乙酸銨溶液(20∶80)為流動(dòng)相，樣品由安捷倫SB-C18色譜柱分離分析；柱溫為35 ℃；流速為1 mL·min-1；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；波長(zhǎng)為250 nm。將衍生化的樣品溶液通過0.22 μm微孔濾膜，取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定。

3.5實(shí)驗(yàn)條件的選擇 分別以含量較高的4種單糖(葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖)的峰面積為指標(biāo)，測(cè)試不同TFA濃度、水解時(shí)間及衍生化時(shí)間對(duì)多糖水解程度的影響。結(jié)果顯示，隨TFA濃度的增加和水解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖逐步水解，單糖量逐漸增加。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最終實(shí)驗(yàn)條件為：TFA濃度為3 mol·L-1，水解時(shí)間和衍生化時(shí)間均為1 h。

3.6方法學(xué)考察

3.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 取單糖混合對(duì)照品溶液 5 份，加入不同體積的純水稀釋成系列質(zhì)量濃度梯度溶液，按照3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按照3.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各質(zhì)量濃度下的單糖峰面積，結(jié)果顯示，單糖質(zhì)量濃度(x)與單糖峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比值(y)之間線性關(guān)系良好，見表1。

表1單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

Tab.1 Standard curves and linear ranges of monosaccharides

單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線r線性范圍/μg·mL-1甘露糖 y=0.587x-0.0220.999 90.045^45.0葡萄糖 y=0.191x+0.0120.999 70.112^56.0半乳糖y=0.211x-0.0060.999 50.103^51.5阿拉伯糖 y=0.186x-0.0170.999 90.110^55.0巖藻糖y=0.235x+0.0110.999 90.099^49.5

3.6.2精密度實(shí)驗(yàn) 將制備的藤梨根供試品溶液進(jìn)樣 5 次，測(cè)定各組分的峰面積并分別計(jì)算其含量及RSD值。結(jié)果顯示，各單糖組分含量的RSD值在0.42%～1.5%之間，提示該方法的精密度符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.6.3加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知多糖含量藤梨根供試品，精密稱定，置于量瓶中，分別精密加入相當(dāng)樣品含有量的各單糖對(duì)照品，按照3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，依照3.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖的平均回收率分別為93.1%(RSD=1.5%)，95.7%(RSD=1.2%)，98.6%(RSD=0.9%)，98.1%(RSD=1.5%)和93.6%(RSD=0.8%)，表明該方法符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.6.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將供試品溶液分別在0，2，4和8 h進(jìn)樣，根據(jù)各單糖組分的峰面積計(jì)算其各組分的RSD值。結(jié)果表明，各組分峰面積的RSD值在0.69%～1.8%之間，說明山豆根多糖的供試品溶液在8 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，滿足分析要求。

3.7樣品測(cè)定與結(jié)果分析 將收集的3批商品藥材及3批自采原藥材分別取皮部及木部，按照3.1項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按照3.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖2，單糖的測(cè)定結(jié)果見表2和表3。

圖2藤梨根樣品多糖水解產(chǎn)物中單糖衍生化產(chǎn)物HPLC圖

）a.混和對(duì)照品；b.皮部樣品；c.木部樣品；1.甘露糖；2.PMP；3.內(nèi)標(biāo)；4.葡萄糖；5.半乳糖；6.阿拉伯糖；7.巖藻糖。

Fig.2 HPLC chromatograms of derivatization products of monosaccharides hydrolyzated from polysaccharides in RadixActinidiaechinensissample

）a.mixed reference material；b.cortex sample；c.xylem sample；1.mannose；2.PMP；3.internal standard；4.glucose；5.galactose；6.arabinose；7.fucose.

表2多糖水解產(chǎn)物中單糖的測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Analysis results of monosaccharides hydrolyzed from polysaccharides(mg·g-1)

樣品甘露糖 葡萄糖 半乳糖阿拉伯糖 巖藻糖P10.013 37.024 110.634 22.855 80.902 1P20.008 016.309 39.340 32.565 70.920 4P30.007 12.600 31.373 30.662 30.322 6P40.004 10.192 80.977 4 0.304 80.265 6P50.006 20.481 62.498 70.730 70.369 2P60.008 92.317 52.821 50.867 80.321 3M1―3.648 30.292 10.155 9―M2―6.929 80.398 30.189 6―M3―2.248 20.128 60.087 0―M4―1.315 10.095 50.072 5 ―M5―1.270 60.499 80.178 3―M60.003 71.966 30.726 10.277 40.116 0

注：P表示皮部；M表示木部；-表示低于檢測(cè)限。

表3多糖中單糖的摩爾質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)算結(jié)果

Tab.3 Calculated results of the number of moles of monosaccharides hydrolyzed from polysaccharides

樣品甘露糖/%葡萄糖/% 半乳糖/%阿拉伯糖/%巖藻糖/%P10.0631.8048.1415.514.48P20.0354.8331.4010.353.40P30.1450.6926.7715.496.90P40.2310.5353.3619.9715.91P50.1411.2858.5420.549.49P60.1435.4343.1315.925.39M1―88.397.084.53― M2―91.725.273.01― M3―90.615.184.21― M4―87.816.385.81― M5―64.0325.1910.78― M60.1262.3023.0010.554.04

注：P表示皮部；M表示木部；-表示低于檢測(cè)限。

樣品中各組分含量的比例有明顯差異，說明藥材的產(chǎn)地和生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)多糖組分有較大影響。盡管如此，在不同藥用部位中也顯示出一些共有特征。皮部和木部單糖組分的含量分別在0.004 1～16.303 9和0.003 7～6.929 8 mg·g-1之間，皮部含量明顯高于木部。另外，自采原藥材中單糖組分的含量也明顯高于市場(chǎng)上銷售的飲片。皮部多糖均含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖，而木部除了一批藥材測(cè)出甘露糖和巖藻糖外，多糖多由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成。皮部多糖主要以葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖為構(gòu)成主體，而木部主要以葡萄糖為構(gòu)成主體。

4 結(jié)論

本文基于顯微鑒定技術(shù)在組織構(gòu)造上分析了藤梨根藥材皮部與木部的區(qū)別。由于組織構(gòu)造差異大，導(dǎo)致商品藥材在現(xiàn)代薄片切制工藝的過程中皮部易脫落，飲片外觀以木質(zhì)部為主。同時(shí)皮部也比木部有更多的細(xì)胞后含物，這些后含物往往是活性成分的重要來源。因此，商品藥材中僅以木質(zhì)部為主不但與傳統(tǒng)的藥用部位相違背，也缺失了可能的活性成分。

多糖的單糖組成對(duì)其生物活性有重要的影響，糖單元的組成決定了多糖的種類，其生物活性也受其影響，更復(fù)雜的單糖構(gòu)成印證更好的活性。本文采用顯微鑒定技術(shù)界定皮部與木部，分別對(duì)皮部與木部的多糖進(jìn)行提取，再水解后衍生化處理，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析藥材中皮部與木部的區(qū)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自采原藥材中單糖組分的含量明顯高于市場(chǎng)上銷售的飲片，皮部中多糖單糖的組分種類與含量明顯高于木部。多糖結(jié)構(gòu)的測(cè)定還有待進(jìn)一步研究。隨著多糖生物活性越來越受到重視，含量高且組分多的皮部是藤梨根藥效發(fā)揮中不可或缺的藥用部位，本實(shí)驗(yàn)為藤梨根藥用部位的正確使用提供參考依據(jù)。