肝細(xì)胞癌患者血清miR-301表達(dá)變化及意義

楊永飛，孫運(yùn)秀，蔡鈞

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院，武漢430014)

研究表明，非編碼微小核糖核酸(microRNA)可能參與了各種腫瘤的發(fā)生與惡性進(jìn)展過程[1～3]，血清microRNA水平檢測有助于腫瘤診斷和患者預(yù)后判斷[4]。miR-301是定位于SKA2基因內(nèi)含子中的一種microRNA，其在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞増殖、遷移、侵襲能力及微血管密度相關(guān)[5]。近期研究表明，miR-301在前列腺癌和胰腺癌組織中表達(dá)升高[6]，而在膽管細(xì)胞癌組織中表達(dá)下降[7]。研究表明，肝細(xì)胞癌組織中miR-301表達(dá)明顯高于癌旁正常組織[8]。但是關(guān)于血清miR-301表達(dá)在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中作用的報(bào)道較少。本研究觀察了肝細(xì)胞癌患者血清miR-301表達(dá)變化，探討其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 臨床資料

1.1 臨床資料 選擇2011年1月～2012年6月我院收治的肝細(xì)胞癌患者75例作為觀察組，男46例、女29例，年齡<55歲24例、≥55歲51例；腫瘤直徑<5 cm 19例，≥5 cm 56例；有門靜脈癌栓34例，無門靜脈癌栓41例；血清甲胎蛋白(AFP)<400 μg/L 21例，>400 μg/L 54例；血清乙肝表面抗原(HBsAg)陰性17例，陽性58例；分化程度：中高分化25例，低分化50例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期63例，Ⅲ、Ⅳ期12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①擬進(jìn)行手術(shù)治療，術(shù)后病理診斷確診為肝細(xì)胞癌；②術(shù)前均未接受放化療或者其他生物免疫治療。排除合并肝、腎疾病及免疫系統(tǒng)疾病者，合并其他惡性腫瘤、全身嚴(yán)重感染等嚴(yán)重疾病者。選擇同期體檢健康志愿者65例作為對照組，男41例、女24例，年齡<55歲19例、≥55歲46例。兩組性別構(gòu)成比、年齡均具有可比性。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，患者及其家屬均知情同意。

2 方法與結(jié)果

2.2 血清miR-301表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。觀察組入院后第2天、對照組入組后抽取清晨空腹靜脈血3～5 mL，4 ℃條件下3 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層血清至無RNA酶的凍存管中，保存于液氮中。取250 μL血清至1.5 mL EP管中，加入750 μL TRIzol(美國Invitrogen公司)提取總RNA，紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度(OD260/OD280)合格后，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(ALH190-UBN，北京百奧萊博科技有限公司)采用定量PCR擴(kuò)增儀(ABI?7500，美國ABI公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-301相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，觀察組及對照組血清miR-301相對表達(dá)量分別為3.81±1.42、1.13±0.61，兩組比較P<0.01。

2.3 肝細(xì)胞癌患者血清miR-301表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系 肝細(xì)胞癌患者血清miR-301表達(dá)與其年齡、性別、腫瘤直徑和分化程度無關(guān)(P均>0.05)，與門靜脈癌栓、血清AFP水平、血清HBsAg、TNM分期有關(guān)(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 肝細(xì)胞癌患者血清miR-301表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 肝細(xì)胞癌患者血清miR-301表達(dá)與其預(yù)后的關(guān)系 采用門診或者電話隨訪的方式，對肝細(xì)胞癌患者術(shù)后進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為5年。繪制Kaplan Meier生存曲線，記錄患者生存情況。以血清miR-301表達(dá)平均值為界限，血清miR-301表達(dá)≥平均值為miR-301高表達(dá)，<平均值為miR-301低表達(dá)，比較兩者的5年總生存率。肝細(xì)胞癌患者血清miR-301高表達(dá)42例，低表達(dá)33例。Kaplan Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，高表達(dá)者與低表達(dá)者5年總生存率分別為64.29%(27/42)、90.91%(30/33)，兩者比較P<0.01。見圖1。

圖1 血清miR-301低、高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者Kaplan Meier生存曲線

3 討論

癌癥的發(fā)生是一個(gè)多階段、多因素協(xié)同作用，經(jīng)過啟動(dòng)、促癌和演進(jìn)等多個(gè)步驟，多個(gè)癌基因和相關(guān)基因參與，多個(gè)基因發(fā)生突變的結(jié)果[9]。microRNA是一類長19～25個(gè)氨基酸、高度保守的不編碼蛋白的單鏈小RNA分子，是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，可通過靶向mRNA的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)介導(dǎo)mRNA降解或者轉(zhuǎn)錄抑制[10]。microRNA作為一種非編碼的調(diào)控因子，受到越來越多的關(guān)注，其在血清及癌組織中表達(dá)相對穩(wěn)定，是一類潛在的臨床分子標(biāo)記物[11,12]。microRNA參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和侵襲等[13,14]。近年來，有關(guān)microRNA與肝細(xì)胞癌發(fā)生及惡性進(jìn)展的研究已經(jīng)取得了較多成果，發(fā)現(xiàn)多種microRNA在肝細(xì)胞癌組織中存在異常表達(dá)，如miR-21、miR-221、miR-151等在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)[15,16]，miR-122、miR-199a、miR-223等在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)[17]。miR-301基因位于染色體17q22，定位于Ska2內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，其在干細(xì)胞自我更新中可靶向作用于SFRS2及MDB2a基因，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和蛋白質(zhì)組的多樣性[18]，且在肺小細(xì)胞癌等惡性腫瘤中也存在異常表達(dá)[19]。

本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌患者血清miR-301表達(dá)顯著高于健康體檢者，提示miR-301在血清中能夠穩(wěn)定表達(dá)，且miR-301在肝細(xì)胞癌的發(fā)生過程中可能發(fā)揮促癌基因作用。目前，已在肝細(xì)胞癌患者血清中發(fā)現(xiàn)多種microRNA分子能夠穩(wěn)定存在且異常表達(dá)，如miR-4651[20]、miR-21[21]等。本研究分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-301表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑和分化程度不相關(guān)，而有門靜脈癌栓、血清AFP>400 μg/L、血清HBsAg陽性及TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期的肝細(xì)胞癌患者血清miR-301表達(dá)明顯升高。以上結(jié)果說明miR-301可能促進(jìn)肝細(xì)胞癌的血液轉(zhuǎn)移。血清AFP是臨床上診斷肝細(xì)胞癌的血清指標(biāo)之一，本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-301水平與血清AFP水平之間可能呈正相關(guān)性，提示血清miR-301具有作為肝細(xì)胞癌血清診斷指標(biāo)的潛能。Xie等[22]發(fā)現(xiàn)，血清miR-301與乙肝病毒感染的肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌相關(guān)；此外，血清miR-301水平較高可能提示肝細(xì)胞癌患者處于較高的TNM分期。以上結(jié)果均提示，miR-301參與并促進(jìn)了肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展。本研究Kaplan Meier生存分析結(jié)果顯示，miR-301高水平者5年總生存率明顯低于低水平者，提示血清miR-301表達(dá)升高預(yù)示肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后較差，血清miR-301具有作為肝細(xì)胞癌患者不良預(yù)后預(yù)測靶分子的潛能。目前已發(fā)現(xiàn)多種血清microRNA可用于預(yù)測肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后，如miR-210、miR-1和miR-122等[23，24]。此外，介于研究樣本數(shù)量有限，后續(xù)仍需增加樣本量，以獲得更科學(xué)可信的結(jié)論，為肝細(xì)胞癌的診斷治療提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，血清miR-301可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展，肝細(xì)胞癌患者血清miR-301高表達(dá)者的預(yù)后相對較差。