克羅恩病患者外周血Th17、Treg比例變化及其臨床意義

吳萬桂，楊劍，張杰

(1泰康仙林鼓樓醫(yī)院，南京210046；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

克羅恩病病程較長、病情反復(fù)，目前臨床尚無有效的根治手段，治療原則為控制腸道炎癥、緩解癥狀[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳、環(huán)境以及免疫因素等共同作用介導(dǎo)了克羅恩病的發(fā)生、發(fā)展過程，免疫因素的作用尤其重要[3,4]。輔助性T細(xì)胞亞群可合成和分泌多種細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其中輔助性T細(xì)胞17(Th17)通過感染組織并募集中性粒細(xì)胞而促進(jìn)炎性反應(yīng)，參與腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程[5]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是具有免疫抑制作用的CD4+T細(xì)胞亞群，可抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖及活化[6]。Th17與Treg比例失衡可能導(dǎo)致炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生[7]。本研究探討克羅恩病患者外周血Th17及Treg比例變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6月～2017年12月南京市泰康仙林鼓樓醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的克羅恩病患者78例，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組制訂的“炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見”中關(guān)于克羅恩病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。采用克羅恩病疾病活動(dòng)指數(shù)(CDAI)對(duì)患者入院1周內(nèi)的8項(xiàng)指標(biāo)計(jì)分，根據(jù)權(quán)重計(jì)算總分[9]分為輕度活動(dòng)組(總分150～220分)、中度活動(dòng)組(總分221～450分)、重度活動(dòng)組(總分>450，該組無病例，故不納入統(tǒng)計(jì)分析)和緩解組(總分<150分)。輕度活動(dòng)組23例，CDAI為164.1～215.4(184.1±20.3)，其中男14例、女9例，年齡25～67(46.9±13.3)歲；中度活動(dòng)組18例，CDAI為245.1～431.2(346.9±39.5)，其中男10例、女8例，年齡27～73(48.1±12.5)歲；緩解組37例，CDAI為42.1～140.4(97.4±36.7)，其中男20例、女17例，年齡32～75(47.2±13.4)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期及哺乳期女性；②心臟功能不全；③肝、腎功能障礙；④自身免疫性疾病及其他炎癥性疾?。虎輴盒阅[瘤；⑥合并其他可能影響本研究結(jié)果的疾??；⑦近期服用過其他可能影響本研究結(jié)果的藥物，如免疫抑制劑、抗炎藥等。隨機(jī)選取同期健康體檢者30例為對(duì)照組，其中男17例、女13例，年齡34～78(49.5±12.2)歲。各組性別構(gòu)成比、年齡具有可比性。

1.2 外周血Th17、Treg檢測 分別收集克羅恩病患者入院時(shí)、對(duì)照組體檢時(shí)清晨空腹肘靜脈血5 mL，加入250 μL肝素鈉抗凝，隨后將其加入到250 μL RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入含有40.5 μmol/mL PMA、5.3 mmol/mL Brefeldin A、1 mmol/mL Monensin、670 μmol/mL Ionomycin的1 μL刺激阻斷劑，將其置于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。①外周血Th17檢測：采用流式細(xì)胞儀。取刺激后的全血表面標(biāo)記抗人CD8a-FITC、抗人CD3-APC共計(jì)100 μL，避光條件下孵育30 min；隨后加入MEDIUM A液100 μL，室溫條件下孵育15 min，采用流式染色緩沖液清洗1次，加入MEDIUM B液以及抗人IL-17A-PE共100 μL，4 ℃條件下孵育30 min；流式染色緩沖液清洗1次。②外周血Treg檢測：采用流式細(xì)胞儀。取刺激后的全血表面標(biāo)記抗人CD4-FITC、抗人CD25-APC共計(jì)100 μL，避光條件下孵育30 min；隨后加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，室溫下10 min，以流式染色緩沖液清洗1次；1×固定破膜液4 ℃條件下避光60 min，1×固定破膜液清洗2次；加入抗人FOXP3-PE在4 ℃條件下避光孵育30 min，最后以流式染色緩沖液清洗2次。通過FACS Calibur每管獲取30 000個(gè)細(xì)胞，采用Flowjo7.6軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算Th17比例、Treg比例及Th17/Treg。

1.3 炎性指標(biāo)檢測 取兩組血液標(biāo)本，采用免疫比濁法測定血清CRP，血細(xì)胞儀測定血小板分布寬度(PDW)、血小板(PLT)計(jì)數(shù)、平均血小板體積(MPV)，采用魏氏法測定紅細(xì)胞沉降率(ESR)。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血Th17比例、Treg比例及Th17/Treg比較 見表1。

表1 各組外周血Th17比例、Treg比例及Th17/Treg比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；緩解組比較，△P<0.05。

2.2 各組血清炎性指標(biāo)比較 見表2。

表2 各組血清炎性指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；緩解組比較，△P<0.05；與輕度活動(dòng)組比較，#P<0.05。

2.3 活動(dòng)期克羅恩患者外周血Th17比例、Treg比例及Th17/Treg與血清炎性指標(biāo)的相關(guān)性 活動(dòng)期克羅恩患者(中度活動(dòng)組和輕度活動(dòng)組)外周血Th17比例、Th17/Treg與CDAI均呈正相關(guān)(r分別為0.631、0.627，P均<0.05)，與Treg比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.598，P<0.05)；Th17比例與CRP、PLT、ESR均呈正相關(guān)(r分別為0.492、0.437、0.339，P均<0.05)，與MPV呈負(fù)相關(guān)(r=-0.372，P<0.05)；Treg細(xì)胞比例與CRP、PLT、ESR均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.371、-0.309、-0.376，P均<0.05)，與MPV呈正相關(guān)(r=0.361，P<0.05)；Th17/Treg與CRP、PLT、ESR均呈正相關(guān)(r分別為0.506、0.456、0.381，P均<0.05)，與MPV呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.389，P<0.05)。見表3。

表3 活動(dòng)期克羅恩患者外周血Th17比例、Treg比例及Th17/Treg與血清炎性指標(biāo)的相關(guān)性

注：表中數(shù)字為相關(guān)系數(shù)r；*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

克羅恩病的發(fā)病主要與感染、自身免疫缺陷等因素密切相關(guān)。遺傳易感人群免疫功能下降，免疫系統(tǒng)激活后引起免疫細(xì)胞釋放免疫因子，同時(shí)腸道壁黏膜下層的炎性細(xì)胞合成并釋放細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致腸道黏膜壁充血水腫和炎性病變[10,11]。腸道炎性反應(yīng)引起腸道壁出現(xiàn)瘢痕和纖維化改變，并反復(fù)發(fā)作，腸道壁最終在結(jié)腸鏡下發(fā)生卵石樣改變或形成肉芽腫[12]。

研究證實(shí)，Th17與自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)以及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可通過分泌多種相關(guān)的細(xì)胞因子參與感染或者機(jī)體的損傷過程。Th17通過誘導(dǎo)并分泌IL-17、IL-21等炎性細(xì)胞因子來募集中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)展，進(jìn)而參與銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)病過程[13～15]。研究顯示，Treg與Th17的功能相互拮抗，可抑制反應(yīng)性T細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子。Treg通過合成并分泌IL-10、TGF-β等抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子在機(jī)體的免疫防御、維持自身免疫穩(wěn)定中發(fā)揮功能[16,17]。Th17/Treg是免疫“促炎/抑炎”細(xì)胞對(duì)，在正常的生理狀態(tài)下兩者處于動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而預(yù)防炎癥性疾病發(fā)生。Th17/Treg失衡參與炎癥性腸病等多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[18]。本研究結(jié)果顯示，輕度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組Th17比例高于緩解組和對(duì)照組，而Treg比例低于緩解組和對(duì)照組，提示Th17和Treg比例異常參與了克羅恩病腸道炎癥的形成過程，與趙小靜等[19]研究結(jié)果一致。本研究活動(dòng)期患者外周血Th17/Treg明顯高于緩解期患者和對(duì)照組，進(jìn)一步提示Th17/Treg失衡導(dǎo)致的免疫功能紊亂是克羅恩病的誘發(fā)因素。

CRP是反映疾病炎癥狀態(tài)的重要急性期蛋白。本研究結(jié)果顯示，輕度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組血清CRP水平高于緩解組，且中度活動(dòng)組高于輕度活動(dòng)組，提示CRP水平變化亦可反映克羅恩病的炎癥活動(dòng)程度。本研究輕度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組PLT、ESR均高于緩解組和對(duì)照組，MPV低于緩解組和對(duì)照組，且中度活動(dòng)組PLT、ESR高于輕度活動(dòng)組，提示PLT、MPV、ESR均參與了克羅恩病的發(fā)生、發(fā)展過程，是反映疾病活動(dòng)度的重要指標(biāo)，與?ztürk等[20]結(jié)果相似。

CDAI是臨床評(píng)估克羅恩病疾病活動(dòng)程度的重要指標(biāo)，其評(píng)分越高提示疾病活動(dòng)度越強(qiáng)，病情越嚴(yán)重[8,9]。本研究進(jìn)一步的Pearson積矩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Th17比例和Treg比例、Th17/Treg與CDAI呈明顯相關(guān)。提示Th17/Treg是評(píng)估克羅恩病疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。本研究Th17/Treg與血清炎性指標(biāo)呈不同程度相關(guān)，Th17比例和Th17/Treg與CRP、PLT、ESR呈正相關(guān)，與MPV呈負(fù)相關(guān)；Treg比例與CRP、PLT、ESR呈負(fù)相關(guān)，與MPV呈正相關(guān)；提示外周血Th17/Treg失衡可能通過介導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)而參與克羅恩病的發(fā)病過程。

綜上所述，外周血Th17和Treg參與了克羅恩病腸道炎癥形成過程，并且與疾病的活動(dòng)程度密切相關(guān)；Th17/Treg失衡可能通過介導(dǎo)腸道炎性反應(yīng)在克羅恩病發(fā)病過程中發(fā)揮作用。