大腸癌組織P-糖蛋白、核轉(zhuǎn)錄因子κB p65表達(dá)及意義

杜夢(mèng)楠 ，程玉，袁亞男，嚴(yán)曉麗，鄭紀(jì)寧

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥是影響化療效果的主要原因[1]。P-糖蛋白(P-gp)是一種跨膜糖蛋白，具有能量依賴性“藥泵”功能，又稱為ATP能量依賴性藥物輸出泵。其既能與藥物結(jié)合,又能與ATP結(jié)合，可將細(xì)胞內(nèi)藥物泵至細(xì)胞外，從而降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，導(dǎo)致化療效果下降[2,3]。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是一種能夠影響細(xì)胞生存、變異和增殖的重要核轉(zhuǎn)錄因子，可被血清、胰島素、生長(zhǎng)因子、放射線、化療藥物等刺激因子激活[4]。研究證實(shí)，NF-κB信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要的調(diào)控作用[5,6]。NF-κB p65是 NF-κB家族中的重要因子。本研究探討大腸癌組織P-gp、NF-κB p65表達(dá)變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014～2017年承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的大腸癌患者69例，男46例、女23例，年齡35～81歲、中位年齡56.1歲，結(jié)腸癌32例、直腸癌37例，均行大腸癌根治術(shù)。術(shù)前均未行放化療及生物免疫性治療；術(shù)后病理診斷腫瘤為高分化21例、中分化30例、低分化18例，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期25例、Ⅲ+Ⅳ期44例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。

1.2 大腸癌組織及癌旁正常組織P-gp、NF-κB p65表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP法。術(shù)中留取69例患者手術(shù)切除的癌組織，其中41例留取癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)。將癌組織及癌旁正常組織均給予10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片；切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鈉修復(fù)液微波100 ℃ 6 min、80 ℃ 6 min抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液37 ℃溫箱孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，山羊抗血清37 ℃封閉30 min；滴加鼠抗人P-gp單克隆抗體(濃度1∶100)、兔抗人NF-κB p65單克隆抗體(濃度1∶200)，4 ℃過(guò)夜，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次；DAB顯色，封片。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。P-gp主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色顆粒；NF-κB p65主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)于細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色細(xì)顆粒狀。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡(×400)視野，觀察陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～24%為1分，>24%～49%為2分，>49%～74%為3分，>74%為4分。按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)相加后分為4級(jí)，0～1分為-，2分為+，3～4分為++，>5 分為+++。+～+++均為陽(yáng)性。分析大腸腺癌患者P-gp、NF-κB p65表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織及癌旁正常組織P-gp、NF-κB p65表達(dá)比較 癌組織及其癌旁正常組織P-gp陽(yáng)性表達(dá)率分別為89.9%(62/69)、24.4%(10/41)；NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)率分別為84.1%(58/69)、19.5%(8/41)；P均<0. 05。見(jiàn)表1。

表1 大腸癌組織及癌旁正常組織P-gp、NF-κB p65表達(dá)(例)

2.2 大腸癌組織P-gp、NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 大腸癌組織P-gp陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度相關(guān)(P均<0.05)，NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 大腸癌組織P-gp、NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 大腸癌組織P-gp表達(dá)和NF-κB p65表達(dá)的關(guān)系 大腸癌組織P-gp陽(yáng)性51例，其中NF-κB p65陽(yáng)性41例、陰性10例；P-gp陰性18例，其中NF-κB p65陽(yáng)性5例、陰性13例。Spearman相關(guān)分析顯示，大腸癌組織P-gp表達(dá)和NF-κB p65表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.490，P<0.05)。

3 討論

研究證實(shí)，多種因子參與了腫瘤細(xì)胞耐藥[7]，多藥耐藥基因1(MDR1)編碼蛋白P-gp是目前研究最多的耐藥相關(guān)蛋白。P-gp是分子量約為170 kD的跨膜糖蛋白，由位于染色體7q21的人類(lèi)MDR1基因編碼[8]。P-gp由兩個(gè)疏水域組成，其中包括由跨膜α-螺旋組成的藥物結(jié)合領(lǐng)域，參與運(yùn)送毒素和外來(lái)化合物進(jìn)出細(xì)胞[9]。細(xì)胞質(zhì)中的兩個(gè)核苷酸結(jié)合域負(fù)責(zé)將ATP水解與傳輸過(guò)程耦合起來(lái)，可通過(guò)ATP水解獲得能量，將化療藥物泵出細(xì)胞外從而影響化療效果。P-gp是與 MDR 相關(guān)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，P-gp抑制劑可能成為逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的藥物[10～12]。但P-gp與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的報(bào)道鮮見(jiàn)。

NF-κB是一種廣泛存在和功能多樣的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，具有多向調(diào)節(jié)功能。其不僅可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化，還可促進(jìn)腫瘤血管生成。至今在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有五種NF-κB，包括p50、p52、RelA、RelB、CRel[13]。其中p50和p65是NF-κB 家族中最重要的兩個(gè)因子，通常情況下在胞質(zhì)中的NF-κB p65處于失活狀態(tài)，與抑制蛋白IkB和p50結(jié)合形成三聚體。機(jī)體內(nèi)NF-κB的活化受到精密調(diào)控，當(dāng)受到外界因子如炎癥因子、藥物、紫外線等刺激時(shí)，IkB隨即從三聚體中解離出來(lái)，經(jīng)泛素化修飾后通過(guò)蛋白酶解體，使受到IkB抑制的NF-κB p65暴露其核定位序列，迅速?gòu)募?xì)胞質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)，與核內(nèi)的特定序列結(jié)合，從而啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在細(xì)胞增殖、凋亡等方面發(fā)揮重要作用。miR-9可通過(guò)調(diào)節(jié) NF-κB抑制卵巢癌和胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]；miR-195能負(fù)向調(diào)節(jié)IKK表達(dá)，從而降低肝癌細(xì)胞中NF-κB活性[16]；miR-199a和miR-214均受Twist1調(diào)控，能激活I(lǐng)KKβ/NF-κB和PTEN/ATK途徑，進(jìn)而影響卵巢上皮癌干細(xì)胞的分化[17～19]。

本研究結(jié)果顯示， 大腸癌組織P-gp和NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，表明二者過(guò)表達(dá)參與了大腸癌的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，P-gp表達(dá)與大腸癌分化程度、浸潤(rùn)深度有關(guān)，NF-κB p65表達(dá)與大腸癌分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；表明二者參與了大腸癌的發(fā)展。大腸癌組織中P-gp和NF-κB p65表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明二者協(xié)同調(diào)控大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述， P-gp與NF-κB p65可促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，二者起協(xié)同作用；但二者作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。