環(huán)巴胺對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響及作用機(jī)制

杜建紅，范春水，張虹

(山西藥科職業(yè)學(xué)院，太原030031)

肺癌細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)變化參與了細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控[1,2]。Hedgehog信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，由配體Shh、2個(gè)膜受體Patched(Ptch)、G蛋白偶聯(lián)受體超家族的7次跨膜蛋白Smo和下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli家族組成，主要參與胚胎發(fā)育、組織再生及修復(fù)等過(guò)程，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和存活參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。環(huán)巴胺是近年來(lái)常用的抗惡性腫瘤藥物，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用，但其作用機(jī)制尚未明確。2016年1月～2017年6月我們進(jìn)行本研究，觀察環(huán)巴胺對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為及其對(duì)Hedehog通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；CCK-8試劑盒、Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購(gòu)于BD公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞置于含有10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.125%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于以下研究。

1.3 環(huán)巴胺干預(yù)及相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 細(xì)胞增殖情況 采用CCK-8法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，將含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基更換為不含血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，隨機(jī)分為對(duì)照組和環(huán)巴胺組，環(huán)巴胺組加入終濃度為20 μmol/L的環(huán)巴胺培養(yǎng)，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48 h時(shí)每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.2 細(xì)胞遷移能力 采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，隨機(jī)分為對(duì)照組和環(huán)巴胺組，兩組處理方法同1.3.1。培養(yǎng)24 h時(shí)(T0)采用200 μL無(wú)菌移液器槍頭在培養(yǎng)板底部進(jìn)行“1”字形劃痕，顯微鏡下觀察劃痕并拍照記錄；繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h，顯微鏡下觀察劃痕并拍照記錄。采用Image J軟件分析數(shù)據(jù)并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(T0時(shí)劃痕寬度-各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度)/T0時(shí)劃痕寬度×100%。

1.3.3 細(xì)胞侵襲能力 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL加入至小室中，隨機(jī)分為對(duì)照組和環(huán)巴胺組，兩組處理方法同1.3.1。在每個(gè)Transwell小室對(duì)應(yīng)的細(xì)胞孔內(nèi)加入60 μL DMEM-F12培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)12、24、36、48 h時(shí)取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞和Matrigel膠。固定后沖洗，顯微鏡(200×)下觀察，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 Hedehog通路相關(guān)蛋白Shh、Ptch1、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(Gli1)mRNA表達(dá) 采用熒光定量PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和環(huán)巴胺組，兩組處理方法同1.3.1；收集培養(yǎng)48 h的兩組細(xì)胞，提取總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，取cDNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增基因Shh、Ptch1、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(Gli1)[4]。Shh引物：上游：5′-ACCGAGGGCTGGGACGAAGA-3′，下游：5′-ATTTGGCCGCCACCGAGTT-5′；Ptchl引物：上游：5′-CTCCTTTGCGGTGGACAA-3′，下游：5′-CCTCAGCCTTATTCAGCATTTC-3′；Glil引物：上游：5′-CTGGACCTGCAGACGGTTATC-3′，下游：5′-AGCCTCCTGGAGATGTGCAT-3′；內(nèi)參β-actin引物：上游：5′-CATCCTGGGTCTGGACCTGG-3′，下游：5′-ATTTGGGGTGCACGATGGAGGG-3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 環(huán)巴胺組培養(yǎng)12、24、36、48 h時(shí)A值均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖能力比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞遷移率比較 環(huán)巴胺組培養(yǎng)12、24、36、48 h時(shí)細(xì)胞遷移率均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組細(xì)胞遷移率比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

2.3 兩組穿膜細(xì)胞數(shù)比較 環(huán)巴胺組培養(yǎng)12、24、36、48 h時(shí)穿膜細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組穿膜細(xì)胞數(shù)比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

2.4 兩組Shh、Ptch1、Gli1 mRNA表達(dá)比較 環(huán)巴胺組Shh、Ptch1、Gli1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組Shh、Ptch1、Gli1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

環(huán)巴胺是從山藜蘆中分離得到的一種異甾體類生物堿[5,6]。有研究報(bào)道，環(huán)巴胺具有抗腫瘤作用，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，且在胰腺癌、膽管癌、卵巢癌、肝癌等的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)[7～11]。另外，環(huán)巴胺與一些抗腫瘤常規(guī)化療藥物如5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用可增加其腫瘤效果[12,13]。但環(huán)巴胺不溶于水，也很難溶解在有機(jī)或者無(wú)機(jī)溶劑中，限制了其在臨床的應(yīng)用。目前關(guān)于環(huán)巴胺與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。肺癌細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移與機(jī)體多種基因表達(dá)異常密切相關(guān)，篩選影響肺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的基因有助于肺癌的靶向治療，亦有利于對(duì)肺癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)管理[6]。本研究結(jié)果顯示，環(huán)巴胺可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，提示環(huán)巴胺可抑制肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

Alam等[14]報(bào)道，環(huán)巴胺酒石酸鹽可通過(guò)促進(jìn)線粒體分裂和分化、促進(jìn)線粒體膜超極化以及產(chǎn)生活性氧等機(jī)制，減弱線粒體呼吸，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。Hedgehog信號(hào)通路中Ptch能夠與Smo結(jié)合而使Smo喪失活性，從而抑制Hedgehog通路的傳導(dǎo)[15]。當(dāng)Hedgehog信號(hào)通路激活時(shí)，Hedgehog與Ptch結(jié)合，其對(duì)Smo的抑制作用被解除而激活，進(jìn)一步激活Hedgehog信號(hào)通路最下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli，最終調(diào)控組織細(xì)胞靶基因的特異性表達(dá)[16]。Hedgehog基因突變失活可誘發(fā)多種先天畸形和惡性腫瘤[17,18]。研究提示，Hedgehog信號(hào)通路中Hedgehog基因突變可誘發(fā)胃癌、肺癌等多種腫瘤。陳晶等[4]研究顯示，乳腺癌組織Shh mRNA相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于癌旁組織，Shh基因異常表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)；非復(fù)發(fā)乳腺癌組織中Shh mRNA相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)低于復(fù)發(fā)組織，提示Shh與乳腺癌患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)關(guān)系密切。邵力偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Shh、Ptch1及Gli1在乳腺癌組織中均呈高表達(dá)，不同濃度環(huán)巴胺均可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。胰腺癌組織中Ptch1 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于癌旁組織，并且與胰腺癌的分化程度和TNM分期明顯相關(guān)。

Hedgehog信號(hào)通路與肺癌關(guān)系的研究目前相對(duì)較少，并且存在一些爭(zhēng)議。Yuan等[20]研究顯示，不同亞型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系通過(guò)自分泌途徑可激活Hedgehog通路和其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1；如果將細(xì)胞中Gli1基因敲除，上述細(xì)胞系表現(xiàn)為對(duì)Hedgehog信號(hào)通路抑制劑敏感。非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中所有Hedgehog信號(hào)分子均高表達(dá)，在肺鱗癌中Path1和Smo明顯高表達(dá)[21]。Chi等[22]報(bào)道，84.2%的非小細(xì)胞肺癌組織中Shh陽(yáng)性表達(dá)，僅10.5%有Ptch/Gli 陽(yáng)性表達(dá)。Vestergaard等[23]研究顯示，85%的小細(xì)胞肺癌患者的肺癌組織中存在Gli表達(dá)；而20株體外培養(yǎng)的不同小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中僅有1株細(xì)胞檢測(cè)到Gli1陽(yáng)性表達(dá)，2株細(xì)胞Shh陽(yáng)性表達(dá)。Watkins等[24]認(rèn)為，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路持續(xù)激活，相關(guān)產(chǎn)物均高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，環(huán)巴胺抑制Hedgehog信號(hào)通路Shh、Ptch1、Gli1表達(dá)，提示環(huán)巴胺可抑制肺癌細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路上各蛋白表達(dá)，從而抑制Hedgehog信號(hào)通路的生物學(xué)作用，環(huán)巴胺對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用的生物學(xué)靶點(diǎn)可能是Hedgehog信號(hào)通路。

綜上所述，環(huán)巴胺抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，抑制Hedgehog信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白Shh、Ptch1、Gli1可能成為肺癌治療的靶點(diǎn)。