Eya2基因沉默對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制

劉重遠(yuǎn)

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng)110004)

Eya家族是一個(gè)進(jìn)化上比較保守的基因家族，因其特有的C端編碼271個(gè)氨基酸的保守性較高的Eya結(jié)構(gòu)域而得名[1,2]。目前已物Eya基因包括Eya1～Eya3[3，4]。Eya基因編碼的蛋白質(zhì)是一類(lèi)重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控細(xì)胞中多條重要信號(hào)通路[4～6]。Eya2是Eya家族的重要成員之一，在人類(lèi)多種惡性腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮原癌基因作用。研究發(fā)現(xiàn)，Eya2轉(zhuǎn)基因小鼠中PI3K/蛋白激酶B(AKT)/mTOR級(jí)聯(lián)信號(hào)通路活性增強(qiáng)[7]，而在前列腺癌細(xì)胞中Eya2是否對(duì)該通路有影響尚未明確。2016年10月～2017年11月，本研究觀察了Eya2基因沉默對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制是否與AKT信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1及前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145、LNCAP均購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司，細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光液均購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，MTT溶液、吉薩姆染色液、多聚甲醛、蘇木精染色液、Annexin V/PI染色試劑盒均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；Eya2 siRNA購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司，干擾試劑DharmaFECT1購(gòu)于美國(guó)GE Dharmacon公司。主要儀器：磁力攪拌器、電子天平均購(gòu)于梅特勒-托利多公司，超純水系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，電泳儀、轉(zhuǎn)印槽均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于以色列DNR公司，超凈工作臺(tái)、超聲波破碎儀、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀均購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司，恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于日本三洋公司，倒置顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1及前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145、LNCAP復(fù)蘇后，以5×103個(gè)/孔均勻接種于6孔培養(yǎng)板中。37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合至約90%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，收集消化后的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 正常前列腺上皮細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞Eya2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1及前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145、LNCAP，加入適量的裂解液，冰上靜置10 min。將細(xì)胞混合液用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，所得上清液即為樣本的總蛋白提取液。采用酶標(biāo)儀對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量，與蛋白上樣緩沖液進(jìn)行混合。將蛋白混合液于沸水浴中煮沸5 min，并于室溫下冷卻。蛋白上樣量為10 μL，上樣結(jié)束后接通電源，調(diào)整電壓為120 V，完成電泳。電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，并進(jìn)行非特異性蛋白封閉。加入一抗Eya2、GAPDH(稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000、1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000)，37 ℃孵育2 h。將ECL發(fā)光液均勻滴加在PVDF膜上，進(jìn)行底物發(fā)光，并通過(guò)凝膠成像儀記錄和保存。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值計(jì)算Eya2相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，RWPE-1及PC-3、DU145、LNCAP細(xì)胞Eya2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.22±0.01、1.12±0.02、0.84±0.01、0.67±0.01， PC-3、DU145、LNCAP細(xì)胞Eya2蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于RWPE-1細(xì)胞(P均<0.05)。PC-3細(xì)胞Eya2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于DU145、LNCAP細(xì)胞。本研究選擇PC-3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Eya2基因沉默及其對(duì)PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲能力影響的觀察

1.4.1 Eya2基因沉默及效果 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌細(xì)胞PC-3，制備細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔均勻接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)成為單層貼壁狀態(tài)后，隨機(jī)分為沉默組和對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。沉默組和對(duì)照組分別通過(guò)DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Eya2 siRNA、Negative siRNA，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)Eya2表達(dá)。①Eya2蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。取兩組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，參照1.3的方法檢測(cè)兩組Eya2蛋白相對(duì)表達(dá)量。②Eya2 mRNA表達(dá)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取兩組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取總RNA，使用PrimeScript RT Master mix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用SYBR Green Master Mix Kit試劑盒及ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。Eya2引物序列：上游：5′-TCTCACCCAGCCTCACTGTAAAC-3′，下游：5′-TC-AGAGTCCACACAGCAGCGTC-3′。內(nèi)參基因β-actin引物序列：上游：5′-CCAACCGCGAGAAGATGACC-3′，下游：5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Eya2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，沉默組與對(duì)照組Eya2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.630±0.012、0.800±0.009，Eya2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.360±0.006、1.030±0.005，沉默組Eya2蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)。證實(shí)成功沉默PC-3細(xì)胞中的Eya2基因表達(dá)。

1.4.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。取1.4.1中兩組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔均勻接種于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37 ℃條件下培養(yǎng)4 h；去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm處的光密度(OD)值，以O(shè)D490值表示細(xì)胞增殖能力。連續(xù)檢測(cè)5天。

1.4.3 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取1.4.1中兩組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，PBS緩沖液漂洗。用250 μL PBS緩沖液將細(xì)胞進(jìn)行重懸，1%多聚甲醛固定。加入5 mg/mL碘化丙啶及Annexin V/FITC，避光條件下染色15 min。將經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，軟件分析活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞以及死亡細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。取1.4.1中兩組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞加入到Transwell上室中，下室加入含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h。將未穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞用棉簽輕輕擦去，將穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，蘇木精染色。200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)，取平均值，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.4.5 細(xì)胞AKT信號(hào)通路相關(guān)因子檢測(cè) 取1.4.1中兩組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，參照1.3的方法檢測(cè)AKT信號(hào)通路相關(guān)因子p-AKT、Bcl-xl蛋白相對(duì)表達(dá)量，p-AKT、Bcl-xl稀釋倍數(shù)均為1∶1 000。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組細(xì)胞增殖能力均呈上升趨勢(shì)。細(xì)胞培養(yǎng)2～5天沉默組OD490值均低于對(duì)照組(P均<0.05)。兩組培養(yǎng)5天細(xì)胞增殖能力比較見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖能力比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較 沉默組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為(4.09±0.24)%、(1.31±0.19)%，兩組比較P<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較 沉默組與對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(51.07±1.36)、(95.65±2.31)個(gè)，兩組比較P<0.05。

2.4 兩組細(xì)胞p-AKT、Bcl-xl蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 沉默組p-AKT、Bcl-xl蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組細(xì)胞p-AKT、Bcl-xl蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

脊椎動(dòng)物Eya家族包含四種轉(zhuǎn)錄激活因子，即Eya1、Eya2、Eya3、Eya4，該家族基因在進(jìn)化上比較保守[4,8,9]。Eya基因編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在多種生物的胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，還具有調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用[6,10]。Eya基因發(fā)生突變或者表達(dá)異?？梢詫?dǎo)致生物體多種器官發(fā)育異常、遺傳性疾病及惡性腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，Eya2表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用基因干擾技術(shù)敲除Eya2后乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲均受到抑制，細(xì)胞凋亡水平顯著升高[11]。在肺癌細(xì)胞中，miR-30以Eya2為直接作用靶基因，通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞Eya2表達(dá)水平抑制肺癌發(fā)展[7]。在人卵巢癌細(xì)胞中，Eya2表達(dá)上調(diào)，并且與患者不良預(yù)后及較低的生存率有關(guān)[12]。在感染人乳頭狀瘤病毒的宮頸角質(zhì)細(xì)胞中，敲除Eya2基因后細(xì)胞的活力、細(xì)胞的增殖能力及轉(zhuǎn)移能力都受到不同程度的抑制[13]。

細(xì)胞通過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)控制細(xì)胞分裂過(guò)程，從而維持正常細(xì)胞增殖過(guò)程和機(jī)體代謝。細(xì)胞周期的調(diào)控是由一系列重要的信號(hào)分子和周期蛋白家族來(lái)完成的，當(dāng)相關(guān)基因發(fā)生突變或者表達(dá)水平發(fā)生變化時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控的改變，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、分化能力減弱，喪失細(xì)胞原有生理功能，最終發(fā)展成為腫瘤細(xì)胞[14,15]。Eya在許多腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)，并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖[16]、血管形成、侵襲遷移以及凋亡等過(guò)程[16～18]。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145、LNCAP中Eya2蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1，說(shuō)明前列腺癌細(xì)胞中Eya2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，Eya2蛋白表達(dá)升高可能參與了前列腺癌的發(fā)生過(guò)程。

細(xì)胞的增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡是機(jī)體維持正常運(yùn)轉(zhuǎn)的前提，當(dāng)這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，細(xì)胞增殖過(guò)度、凋亡不足均會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生惡變[19]。惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性是其具有局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的腫瘤不僅可以在原發(fā)部位繼續(xù)生長(zhǎng)，更重要的是其能夠向周?chē)M織和細(xì)胞直接蔓延，還可以通過(guò)多種途徑擴(kuò)散至身體的其他部位[20,21]。因此，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力對(duì)腫瘤的惡性蔓延至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)2～5天沉默組細(xì)胞增殖能力均低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，穿膜細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組；說(shuō)明沉默Eya2基因可降低前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力，提高其凋亡能力，有助于抑制前列腺癌的惡性進(jìn)展。

AKT信號(hào)通路在廣泛的人類(lèi)腫瘤譜中失調(diào)，該通路異?；罨捎绊懩[瘤細(xì)胞的多種惡性生物學(xué)行為，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。非磷酸化的AKT蛋白不具備生物學(xué)活性，當(dāng)其經(jīng)過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路的磷酸化作用轉(zhuǎn)變?yōu)閜-AKT時(shí)可以被激活，進(jìn)而通過(guò)不同的機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化等。Bcl-xl是Bcl-2家族蛋白的一員，也是AKT信號(hào)通路下游的靶向蛋白。Bcl-xl在機(jī)體中發(fā)揮抗凋亡蛋白的作用。本研究結(jié)果顯示，沉默組p-AKT、Bcl-xl蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，說(shuō)明沉默Eya2基因后前列腺癌細(xì)胞AKT信號(hào)通路活性受到抑制，其下游抗凋亡靶蛋白Bcl-xl表達(dá)下調(diào)，因此細(xì)胞增殖受到抑制、凋亡水平有所提升。

綜上所述，沉默Eya2基因可降低前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖、侵襲能力，提高細(xì)胞凋亡能力；抑制AKT信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。提示Eya2可能作為診斷和治療前列腺癌的一個(gè)重要靶基因。