LncRNA CCAT1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響及機(jī)制

甘兆義，賈秋紅，關(guān)航

(貴港市人民醫(yī)院，廣西貴港537100)

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，病因包括遺傳及不良環(huán)境因素等[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長(zhǎng)度超過200 nt的非編碼RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控等生物學(xué)過程[2]。LncRNA CCAT1位于染色體8q24.21，其序列位于cMyc的一個(gè)增強(qiáng)子區(qū)2 628 nt[3]。有研究報(bào)道，LncRNA CCAT1在多種腫瘤中異常高表達(dá)，與腫瘤分期及患者預(yù)后相關(guān)[4]。但是，目前尚無LncRNA CCAT1與結(jié)腸癌關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。2016年5月～2017年5月，本研究觀察了LncRNA CCAT1對(duì)體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。E鈣黏蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)一抗購(gòu)自美國(guó)BD公司，二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。LncRNA CCAT1-siRNA及隨機(jī)對(duì)照序列LncRNA CCAT1-NC均由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC均接種于RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后消化傳代。

1.3 LncRNA CCAT1表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480及FHC細(xì)胞，采用qRT-PCR試劑盒檢測(cè)LncRNA CCAT1表達(dá)。LncRNA CCAT1引物：上游：5′-GCCGTGTTAAGCATTGCGAA-3′，下游：5′-AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA-3′。采用定量2-ΔΔCt法計(jì)算 LncRNA CCAT1 相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中LncRNA CCAT1相對(duì)表達(dá)量為7.26±0.53，高于正常結(jié)腸上皮FHC細(xì)胞的1.0±0.03(P<0.05)。提示結(jié)腸癌細(xì)胞中LncRNA CCAT1高表達(dá)。

1.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞隨機(jī)分為CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組和空白對(duì)照組，前兩組采用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染LncRNA CCAT1-siRNA(300 nmol/孔)及隨機(jī)對(duì)照序列LncRNA CCAT1-NC(300 nmol/孔)，空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染處理24 h時(shí)，采用qRT-PCR法檢測(cè)三組LncRNA CCAT1表達(dá)，方法參照1.3。

結(jié)果顯示，CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組、空白對(duì)照組LncRNA CCAT1相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.02、1.13±0.04、1.16±0.08，CCAT1-siRNA組低于Control-siRNA組和空白對(duì)照組(P均<0.01)，提示轉(zhuǎn)染LncRNA CCAT1-siRNA可抑制LncRNA CCAT1表達(dá)。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染24 h的三組細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，以2×103個(gè)/孔種植于96孔板(200 μL/孔)，分別在培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時(shí)每孔加入CCK-8溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在450 nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度(OD)值。

1.6 細(xì)胞凋亡能力檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。將轉(zhuǎn)染24 h的CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組細(xì)胞消化后給予Binding Buffer重懸，混勻后加入Annexin V抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液及PI染料，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞比例以確定細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染24 h的CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至100%融合后，以50 μL Tips槍頭沿培養(yǎng)板中間劃直線，劃線即刻和48 h時(shí)分別在顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕修復(fù)情況。使用WimScratch在線圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Wimasis GmbH)測(cè)定細(xì)胞劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。劃痕愈合率越高，表示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

1.8 E-cadherin、MMP-9、Caspase-3表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。將轉(zhuǎn)染24 h的CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組細(xì)胞裂解、變性，每孔30 μg蛋白上樣，濃縮膠80 V 50 min，分離膠100 V 100 min，常規(guī)轉(zhuǎn)膜；分別加入E-cadherin、MMP-9、Caspase-3及GAPDH一抗(抗體濃度均為1∶300)，4 ℃孵育過夜；分別加入二抗(1∶500)37 ℃孵育4 h；PBST漂洗3次，在ECL液下顯影，Quantity One 1-D分析目標(biāo)蛋白灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞增殖能力比較 轉(zhuǎn)染24 h結(jié)束時(shí)再培養(yǎng)48、72、96 h時(shí)CCAT1-siRNA組OD450值均低于Control-siRNA組及空白對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

表1 三組細(xì)胞增殖能力比較

注：與Control-siRNA組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較 CCAT1-siRNA組細(xì)胞凋亡率為(14.3±1.5)%，Control-siRNA組為(3.5±0.8)%，組間比較P<0.01。

2.3 兩組細(xì)胞劃痕愈合率比較 CCAT1-siRNA組細(xì)胞劃痕愈合率為(31.6±2.5)%，Control-siRNA組為(53.4±4.3)%，組間比較P<0.01。

2.4 兩組細(xì)胞Caspase-3、E-cadherin、MMP-9表達(dá)比較 CCAT1-siRNA組Caspase-3相對(duì)表達(dá)量高于Control-siRNA組，E-cadherin、MMP-9相對(duì)表達(dá)量均低于Control-siRNA組(P均<0.01)。見表2。

3 討論

LncRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄激活或抑制、染色體修飾與沉默、基因組印記等多個(gè)過程都具有調(diào)控功能，并在多種疾病包括腫瘤中發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中LncRNA CCAT1異常高表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。在乳腺癌中，LncRNA CCAT1高表達(dá)與患者的總體生存率密切相關(guān)[7]。在肝癌中，LncRNA CCAT1高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤大小和分期相關(guān)，且LncRNA CCAT1是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子[8,9]。Nissan等[10]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中LncRNA CCAT1表達(dá)高于正常腸黏膜組織。LncRNA CCAT1和LncRNA HOTAIR聯(lián)用可提高結(jié)腸癌的早期診斷率[11]。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中LncRNA CCAT1相對(duì)表達(dá)量高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC，提示LncRNA CCAT1高表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生相關(guān)。

表2 兩組細(xì)胞Caspase-3、E-cadherin、MMP-9相對(duì)表達(dá)量比較

注：與Control-siRNA組比較，*P<0.05。

LncRNA CCAT1位于染色體8q24.21 cMyc基因增強(qiáng)子區(qū)域[12,13]。cMyc能夠通過與LncRNA CCAT1啟動(dòng)子區(qū)域的特定區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)LncRNA CCAT1轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞獲得無限增殖能力，同時(shí)還可抑制細(xì)胞凋亡[6]。另外，對(duì)膀胱癌的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CCAT1通過競(jìng)爭(zhēng)性與miRNA-219-5p結(jié)合，提高其靶基因Bim1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力；敲除LncRNA CCAT1基因后，癌細(xì)胞的增殖能力與侵襲能力均被明顯抑制[14]。本研究我們采用基因轉(zhuǎn)染的方法抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞LncRNA CCAT1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖、侵襲能力均降低，凋亡增加，提示抑制LncRNA CCAT1表達(dá)具有抗結(jié)腸癌的作用。

Caspase-3屬于Caspase家族，是重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白，通常以非活性酶原形式存在，當(dāng)收到凋亡信號(hào)后被激活，進(jìn)一步阻滯細(xì)胞周期，導(dǎo)致染色體聚集、核皺縮、凋亡小體形成等，是反映細(xì)胞凋亡水平的一個(gè)常用指標(biāo)[15]。MMP-9和E-cadherin是腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲過程中重要的標(biāo)識(shí)蛋白。MMP-9屬于MMPs家族，是一類與腫瘤關(guān)系十分緊密的蛋白水解酶。MMP-9通過與多種底物結(jié)合，包括膠原蛋白、明膠、彈性蛋白、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚糖等，發(fā)揮作用[16]。在腫瘤中，MMP-9能夠通過降解胞外基質(zhì)和基底膜，導(dǎo)致癌細(xì)胞突破組織屏障，發(fā)生侵襲甚至遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移；還可以通過釋放血管內(nèi)皮因子，促進(jìn)血管生成，加速癌細(xì)胞增殖[17]。E-cadherin屬于鈣黏素分子家族，其能夠介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，從而協(xié)助細(xì)胞傳遞信號(hào)、維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間識(shí)別和誘導(dǎo)分化等[18]。本研究中，下調(diào)LncRNA CCAT1表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)增加，MMP-9和E-cadherrin表達(dá)均顯著降低。

綜上所述，結(jié)腸癌細(xì)胞中LncRNA CCAT1高表達(dá)；下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中LncRNA CCAT1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-9、E-cadherrin表達(dá)及上調(diào)Caspase-3表達(dá)有關(guān)。提示LncRNA CCAT1在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用，其有望成為結(jié)腸癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。