酪酸梭菌對(duì)阿司匹林致大鼠小腸黏膜損傷的影響及機(jī)制

徐林芳，安敏，沈曼茹，黃繼英，唐鄂，崔英，顏美珠，李曉翠，倪倩雯，高振軍

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院，上海201700)

阿司匹林是最常用的非甾體類(lèi)抗炎藥(NSAIDs)之一，作為抗血小板聚集，防止血栓形成的一線藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。NSAIDs最主要的副作用是消化系統(tǒng)不良反應(yīng)，如胃黏膜炎癥及潰瘍等。近年來(lái)，NSAIDs所致腸道損傷越來(lái)越受到關(guān)注。有研究認(rèn)為，NSAIDs相關(guān)性腸黏膜損傷比NSAIDs相關(guān)性胃黏膜損傷更為常見(jiàn)，可引起小腸出血、蛋白丟失性腸病、回腸吸收功能障礙、腸通透性升高及結(jié)腸出血、穿孔等[1～4]。酪酸梭菌是醫(yī)用功能益生菌，是腸道內(nèi)一類(lèi)產(chǎn)酪酸的益生菌，其產(chǎn)生的酪酸是維持腸黏膜能量代謝、組織再生修復(fù)和腸道免疫平衡的重要物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，抑制腸道不良微生物生長(zhǎng)，且對(duì)致病微生物具有拮抗作用[5]。目前關(guān)于酪酸梭菌對(duì)NSAIDs致胃腸黏膜損傷的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，我們于2013年5月～2015年4月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自上海市第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK[滬]2012-0017)。阿司匹林腸溶片(100 mg/粒，Bayer)；酪酸梭菌活菌(米桑)重慶泰平藥業(yè)有限公司(200 mg/粒)，含酪酸梭菌活菌數(shù)不低于2×107CFU/g。

1.2 大鼠分組及處理 將SD大鼠室溫條件下常規(guī)飼養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型1組、模型2組、干預(yù)1組、干預(yù)2組，每組12只。后四組均制備阿司匹林腸黏膜損傷模型。具體方法：依據(jù)成人有效治療劑量及人與動(dòng)物藥物劑量換算公式計(jì)算出大鼠所需阿司匹林劑量。對(duì)照組給予生理鹽水2 mL灌胃14天；模型1組給予阿司匹林50 mg/kg(用生理鹽水稀釋至2 mL)灌胃14天；模型2組給予阿司匹林50 mg/kg(用生理鹽水稀釋至2 mL)灌胃7天，等量生理鹽水灌胃7天；干預(yù)1組同時(shí)給予阿司匹林50 mg/kg及酪酸梭菌4 mg灌胃14天；干預(yù)2組給予阿司匹林50 mg/kg灌胃7天，再給予酪酸梭菌4 mg灌胃7天。各組大鼠均于給藥14天結(jié)束時(shí)眼眶靜脈取血后處死，取中段小腸40 cm。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 一般情況 各組大鼠均每日測(cè)量體質(zhì)量，進(jìn)行大便常規(guī)檢查，并觀察大鼠一般狀態(tài)。

1.3.2 血清TNF-α、IL-1檢測(cè) 采用ELISA法。取各組眼眶靜脈血，離心后留取血清，檢測(cè)TNF-α、IL-1，具體方法參照試劑盒(北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司)說(shuō)明書(shū)。

1.3.3 小腸黏膜大體形態(tài)及組織病理學(xué)評(píng)分 取小腸組織1 cm常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，對(duì)小腸黏膜大體形態(tài)損傷及組織學(xué)損傷進(jìn)行評(píng)分。腸黏膜大體形態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無(wú)損傷；1分：局部充血、水腫，未出現(xiàn)潰瘍；2分：有潰瘍，不伴黏膜明顯充血、水腫等炎性表現(xiàn)；3分：有潰瘍，伴一處黏膜炎癥；4分：有多處潰瘍和炎癥，潰瘍≤1 cm；5分：有多處潰瘍和炎癥，至少1處潰瘍>1 cm。腸黏膜組織病理學(xué)按Chiuetal 氏法評(píng)分：0分：腸黏膜絨毛正常；1分：腸黏膜絨毛頂端上皮出現(xiàn)囊狀間隙，伴有毛細(xì)血管充血；2分：腸黏膜上皮下間隙擴(kuò)大，固有層中度水腫，中央乳糜管擴(kuò)張；3分：腸黏膜固有層明顯水腫，黏膜上皮層細(xì)胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：腸黏膜上皮細(xì)胞層變性、壞死、脫落，部分絨毛脫落、固有層裸露，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；5分：腸黏膜絨毛脫落，固有層崩解、出血或潰瘍形成。每個(gè)樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，對(duì)每個(gè)視野按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行單獨(dú)評(píng)分，取平均數(shù)為最終病理評(píng)分。

1.3.4 小腸組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及NO水平檢測(cè) 將其余小腸組織放入5 mL燒杯內(nèi)，用勻漿器制成10%組織勻漿，采用ELISA法檢測(cè)MPO、SOD、NO，具體方法參照試劑盒(北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司)說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況比較 造模過(guò)程中各組大鼠均無(wú)死亡。對(duì)照組一般情況良好；其余四組喂食阿司匹林后出現(xiàn)不同程度體質(zhì)量下降、活動(dòng)減少、少食，造模1周后均出現(xiàn)大便隱血陽(yáng)性，模型1、2組上述改變的程度重于干預(yù)1組、2組。見(jiàn)表1。

表1 各組造模前后體質(zhì)量及大便隱血結(jié)果

2.2 各組血清TNF-α、IL-1水平比較 見(jiàn)表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-1水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型1組比較，△P<0.05；與模型2組比較，#P<0.05。

2.3 各組小腸黏膜大體形態(tài)及組織病理學(xué)評(píng)分比較 小腸黏膜大體形態(tài)：對(duì)照組大鼠小腸黏膜無(wú)肉眼可見(jiàn)損傷；其余各組小腸黏膜損傷程度輕重不一，多表現(xiàn)為黏膜局部充血水腫，部分出現(xiàn)腸壁散發(fā)糜爛、潰瘍及增厚。小腸黏膜組織病理學(xué)變化：對(duì)照組大鼠小腸黏膜組織形態(tài)正常，絨毛完整無(wú)脫落；其余各組小腸黏膜組織結(jié)構(gòu)異常，絨毛中心分離壞死、脫落，固有層崩解，出血伴潰瘍形成，黏膜下可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)有充血、水腫。模型1、2組及干預(yù)1、2組大鼠小腸黏膜大體形態(tài)及組織病理學(xué)評(píng)分均高于對(duì)照組，且模型1、2組均高于干預(yù)1、2組，組間比較P均<0.05。見(jiàn)表3。

表3 各組小腸黏膜大體形態(tài)及組織病理學(xué)評(píng)分比較(分，

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型1組比較，△P<0.05；與模型2組比較，#P<0.05。

2.4 各組小腸組織勻漿MPO、SOD及NO水平比較 見(jiàn)表4。

表4 各組小腸組織勻漿MPO、SOD及NO水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型1組比較，△P<0.05；與模型2組比較，#P<0.05。

3 討論

NSAIDs通過(guò)抑制花生四烯酸的環(huán)氧合酶(COX)途徑，減少前列腺素(PGs)和白三烯的合成，進(jìn)而發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕和抗血小板聚集等作用。然而COX有兩種亞型，即COX1和COX2，COX2是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的酶，而COX1是具有生理作用的結(jié)構(gòu)酶。NSAIDs在抑制COX2發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，也導(dǎo)致生理性COX1合成減少，引發(fā)患者出現(xiàn)多種不良反應(yīng)，涉及胃腸道、心血管、腎臟、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)等[6～8]。其中以胃腸道刺激和組織損傷尤為常見(jiàn)，輕者表現(xiàn)為黏膜充血、水腫、糜爛及一過(guò)性淺表潰瘍，重者可造成多發(fā)潰瘍合并消化道出血、穿孔，甚至危及生命。由于NSAIDs本身的鎮(zhèn)痛作用，其所致的腸道損傷多表現(xiàn)為“無(wú)痛性”，即使已存在潰瘍、出血，患者也無(wú)任何主觀感受，延誤疾病治療。本研究采用NSAIDs藥物的代表阿司匹林誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)腸黏膜損傷，結(jié)果顯示阿司匹林處理大鼠小腸黏膜均出現(xiàn)損傷，多表現(xiàn)為黏膜局部充血水腫，部分出現(xiàn)腸壁散發(fā)糜爛、潰瘍及腸壁增厚；組織病理學(xué)上表現(xiàn)為小腸黏膜組織結(jié)構(gòu)異常，絨毛中心分離壞死、脫落，固有層崩解，出血伴潰瘍形成，黏膜下可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)有充血、水腫。進(jìn)一步證實(shí)了阿司匹林對(duì)腸道黏膜的損傷作用。

酪酸梭菌能促進(jìn)雙歧桿菌等反映機(jī)體體內(nèi)定植力的腸道有益菌生長(zhǎng)，提高機(jī)體的定植耐性，抑制G-桿菌等腸道有害菌生長(zhǎng)，恢復(fù)腸道菌群平衡，改善腸道微生態(tài)[8,9]。酪酸梭菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可降低腸道局部pH值，通過(guò)抑制G-桿菌等優(yōu)勢(shì)移位菌的過(guò)度增殖，減少腸道內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，阻斷腸道菌群移位，改善腸道菌群失調(diào)，減輕腸黏膜損傷，促進(jìn)腸黏膜的免疫功能及生理功能恢復(fù)[10～13]。給予阿司匹林致胃潰瘍小鼠酪酸梭菌預(yù)處理，結(jié)果顯示酪酸梭菌可通過(guò)抗氧化應(yīng)激、增加胃黏液量，上調(diào)Bc1-2/Bax，減輕阿司匹林造成的胃潰瘍損傷[14,15]。

MPO是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志物，其產(chǎn)生的氧自由基參與組織損傷及機(jī)體的炎癥反應(yīng)；SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，其濃度越高，提示組織的氧化損傷越大。NO、TNF-α、IL-1作為促炎細(xì)胞因子，由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放，可以激活炎癥反應(yīng)[16，17]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，其余四組腸黏膜組織MPO、NO及血清TNF-α、IL-1水平均升高，且模型1、2組均高于干預(yù)1、2組；SOD水平均降低，模型1、2組均低于干預(yù)1、2組。提示阿司匹林可導(dǎo)致大鼠小腸黏膜氧化應(yīng)激及炎癥損傷，酪酸梭菌可減少氧自由基、NO及促炎癥因子TNF-α、IL-1的過(guò)度產(chǎn)生，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)對(duì)腸道黏膜的損傷。本研究設(shè)置的模型1組各項(xiàng)指標(biāo)變化均高于模型2組，提示阿司匹林致小腸黏膜損傷有一定的時(shí)間依賴(lài)性；兩組間各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與造模動(dòng)物數(shù)量相對(duì)少，觀察時(shí)間點(diǎn)未進(jìn)一步細(xì)分有關(guān)。酪酸梭菌干預(yù)1、2組上述指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示酪酸梭菌均可發(fā)揮抑制腸道黏膜損傷的作用，但干預(yù)時(shí)間對(duì)結(jié)果影響不大。上述結(jié)果還需擴(kuò)大樣本量、細(xì)化酪酸梭菌干預(yù)濃度后進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，酪酸梭菌可用于治療阿司匹林所致的腸道黏膜損傷，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)可能是其作用機(jī)制。