泡沫細(xì)胞DNA甲基化及其對(duì)脂代謝基因SREBP1表達(dá)的影響

李顯東，陳平英，謝華強(qiáng)，彭春艷，張吉才

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000)

冠心病是一種發(fā)生在大、中型動(dòng)脈的慢性疾病，動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是其發(fā)生的病理基礎(chǔ)。外周循環(huán)中血脂增加可導(dǎo)致膽固醇在動(dòng)脈血管的血管壁沉積，T細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)局部血管壁，二者吞噬氧化的脂質(zhì)顆粒并在內(nèi)皮下形成泡沫細(xì)胞，導(dǎo)致動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)成分聚集，形成粥樣斑塊，誘發(fā)血管阻塞、心肌梗死、下肢缺血性壞死、動(dòng)脈瘤和腦梗死等[1～5]。DNA甲基化是一種發(fā)生在DNA序列上的甲基化修飾，主要指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下，基因組DNA胞嘧啶第五位碳原子共價(jià)結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)被修飾為5-甲基胞嘧啶(5-mC)的反應(yīng)。研究顯示，表觀遺傳方式DNA甲基化參與了動(dòng)脈粥樣斑塊的形成和發(fā)展[6]。2015年7月～2017年7月，本研究采用單核細(xì)胞系THP-1構(gòu)建泡沫細(xì)胞即AS粥樣斑塊形成的體外模型，檢測(cè)泡沫細(xì)胞DNMT的表達(dá)變化，探討脂質(zhì)代謝障礙的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，以期為AS的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料

單核細(xì)胞系THP-1購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；含DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)全長(zhǎng)的質(zhì)粒由武漢大學(xué)生命科學(xué)院朱應(yīng)教授惠贈(zèng)；培養(yǎng)基、FBS購(gòu)自Gibco公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒及總RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；引物合成及測(cè)序由武漢擎科生物有限公司完成；PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自Takara公司；Lipofectamine2000購(gòu)于Invitrogen公司；聚偏氟烯(PVDF)膜購(gòu)自Fugene公司；ECL發(fā)光底物購(gòu)自Millipore公司；膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)、GAPDH抗體購(gòu)于Abcam公司；乙酸酯(PMA)購(gòu)于Sigma公司；LDL購(gòu)于武漢艾美捷公司。將LDL置于20 μmol/L的CuSO4溶液中，37 ℃震蕩水浴15 h，濾膜過(guò)濾，制備氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，置于- 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 泡沫細(xì)胞模型建立 將THP-1細(xì)胞懸浮于含10% FBS、1%雙抗的DMEM 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入終濃度為10 nmol/L的PMA培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞貼壁情況，確定THP-1細(xì)胞已分化為巨噬細(xì)胞(在40×10倍顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，并伸出偽足)；用不含血清的培養(yǎng)基饑餓處理24 h；加入含150 nmol/L ox-LDL的DMEM 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；觀察泡沫細(xì)胞形成(在40×10倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，見(jiàn)細(xì)胞為橢圓或不規(guī)則形狀，大小不一，核偏居細(xì)胞一側(cè)，符合泡沫細(xì)胞形態(tài)特征)；油紅“O”染色鑒定脂質(zhì)吞噬情況(在40×10倍顯微鏡下觀察，可見(jiàn)大量紅色脂質(zhì)顆粒環(huán)行分布在細(xì)胞內(nèi)壁)，收集細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，初步證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為泡沫細(xì)胞。

2.2 THP-1單核細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。分別取THP-1單核細(xì)胞及2.1制備的THP-1泡沫細(xì)胞，采用Qiagen試劑盒提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板采用SYBR Green進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)。引物序列：DNMT1引物上游：5′-ACCGCTTCTACTTCCTCGAGGCCTA-3′，下游：5′-GTTGCAGTCCTCTGTGAACACTGTGG-3′；DNMT3A引物上游：5′-GACAAGAATGCCACCAAAGC-3′，下游：5′-CGTCTCCGAACCACATGAC-3′；DNMT3-B引物上游：5′-CCAGCTGAAGCCCATGTT-3′，下游：5′-ATTTGTCTTGAGGCGCTTG-3′；內(nèi)參GAPDH引物上游：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各因子相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在THP-1泡沫細(xì)胞中DNMT1相對(duì)表達(dá)量低于THP-1單核細(xì)胞(P<0.05)，兩種細(xì)胞中DNMT3A、DNMT3B相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。后續(xù)研究選擇DNMT1基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

表1 THP-1單核細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達(dá)比較

注：與THP-1單核細(xì)胞比較，*P<0.05。

2.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將2.1中獲取的泡沫細(xì)胞接種于6孔板(1×106個(gè)/孔)，隨機(jī)分為對(duì)照組、空載體組、DNMT1組，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，空載體組轉(zhuǎn)染空載對(duì)照質(zhì)粒，DNMT1組轉(zhuǎn)染DNMT1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法：將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、質(zhì)粒、Lipofectamine2000等自冰箱取出，復(fù)蘇至室溫；稀釋4.0 μg質(zhì)粒DNA至250 μL OPTI培養(yǎng)基中混勻，稀釋10 μL脂質(zhì)體至250 μL OPTI培養(yǎng)基中混勻，均靜置5 min；上述配置液體混合25 min，均勻加入無(wú)抗生素培養(yǎng)基的細(xì)胞孔中；培養(yǎng)6 h吸出轉(zhuǎn)染液，PBS輕柔吹吸1遍，更換為DMEM 1640完全培養(yǎng)液。收集三組細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)DNMT1蛋白表達(dá)。DNMT1一抗工作液濃度為1 μg/mL；采用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，對(duì)照組、空載體組、DNMT1組DNMT1 蛋白表達(dá)量分別為0.017 2±0.006 8、0.016 9±0.007 9、0.035 7±0.009 5，DNMT1組較其他兩組表達(dá)量升高，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

2.4 SREBP1啟動(dòng)子甲基化檢測(cè) 采用華大基因MassArray甲基化檢測(cè)方法檢測(cè)SREBP1基因啟動(dòng)子CpG島29個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化改變情況。將三組細(xì)胞DNA中沒(méi)有甲基化的C全部轉(zhuǎn)化為U(相當(dāng)于DNA中的T)，使用特殊設(shè)計(jì)的一對(duì)引物擴(kuò)增樣本，得到帶有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。在體外轉(zhuǎn)錄體系中，利用T7 RNA聚合酶將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA片段。利用RNase A能夠特異性識(shí)別并切割RNA中U3′端的特性，將RNA片段切割成攜帶有CpG位點(diǎn)的小片段。在相同的片段中，使用MassArray飛行質(zhì)譜分析系統(tǒng)檢測(cè)產(chǎn)物。結(jié)果顯示，與對(duì)照組、空載體組比較，DNMT1組SREBP1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島22號(hào) CG位點(diǎn)啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化，而其他28個(gè)CG位點(diǎn)的未發(fā)生甲基化。

注：A為SREBP1基因啟動(dòng)子部分序列(共499 bp)，CG為CpG島可檢出CG位點(diǎn)，CG為因序列原因無(wú)法檢出的CG位點(diǎn)。B中圓點(diǎn)代表檢測(cè)序列中的CpG位點(diǎn)。C為T(mén)HP-1泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNMT1質(zhì)粒后SREBP-1啟動(dòng)子甲基化變化情況。

圖1質(zhì)譜法檢測(cè)SREBP1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平所包含序列及位點(diǎn)信息

2.5 SREBP1 mRNA和SREBP1蛋白表達(dá) ① SREBP1 mRNA表達(dá)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，具體方法參照2.2。SREBP1引物上游： 5′-ACGGCAG-CCCCTGTAACGACCACTGTGA-3′，下游5′-TGCCAA-GATGGTTCCGCCACTCACCAGG-3′。② SREBP1蛋白表達(dá)：采用Western blotting法，具體方法參照2.3。結(jié)果顯示，DNMT1組SREBP1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較其他兩組降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組SREBP1 mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空載體組比較，△P<0.05。

3 討論

DNA甲基化是一種發(fā)生在DNA序列上的甲基化修飾，由DNMT催化。在DNMT家族中，DNMT1的功能主要是在DNA復(fù)制和修復(fù)中維持子代鏈與親代鏈一致的甲基化模式。本研究構(gòu)建了THP-1單核細(xì)胞泡沫化模型，發(fā)現(xiàn)在THP-1泡沫化之后DNMT1表達(dá)顯著降低，提示冠心病發(fā)病機(jī)制中甲基化模式可能受到異常的DNMT1表達(dá)調(diào)控。既往在冠心病患者外周血白細(xì)胞、ApoE敲除小鼠主動(dòng)脈、人進(jìn)展期粥樣斑塊中均觀察到基因組DNA總體甲基化水平降低的現(xiàn)象[7,8]，在AS斑塊區(qū)的特定基因如超氧化物歧化酶基因低甲基化可能與DNMT的表達(dá)變化相關(guān)[9]。DNMT3的主要功能是使未甲基化的CpG位點(diǎn)發(fā)生新甲基化，即參與DNA的從頭甲基化，包括兩個(gè)從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT3B和一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白DNMT3L。與普通飲食的野生型小鼠相比，高脂飲食的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠肝臟組織中DNMT3A及DNMT3B表達(dá)均顯著升高，提示異常的DNA重新甲基化調(diào)控可能在肝臟脂質(zhì)代謝的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究THP-1泡沫細(xì)胞和單核細(xì)胞中DNMT3A及DNMT3B表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示泡沫細(xì)胞的形成可能與DNMT3A及DNMT3B無(wú)關(guān)。

目前對(duì)于單個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化與冠心病的關(guān)聯(lián)分析是冠心病發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)[10]。Afzali等[11]通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇代謝基因NPC1基因啟動(dòng)子甲基化可抑制NPC1表達(dá)，促進(jìn)冠心病的發(fā)生、發(fā)展；Jiang等[12]報(bào)道，脂蛋白相關(guān)磷脂酶(PLA2G7)基因啟動(dòng)子甲基化與冠心病的發(fā)病顯著相關(guān)；Friso等[13]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)7啟動(dòng)子異常高甲基化與更高的FⅦa血漿濃度和冠心病危險(xiǎn)有關(guān)。由此提示，異常的甲基化模式操控脂代謝基因的表達(dá)，從而影響脂質(zhì)代謝，可能是冠心病的發(fā)病機(jī)制之一。

脂質(zhì)代謝紊亂是冠心病的發(fā)病基礎(chǔ)，過(guò)剩的脂質(zhì)沉積在動(dòng)脈內(nèi)膜是動(dòng)脈粥樣斑塊形成的始動(dòng)因素。SREBP1屬于堿性螺旋-環(huán)螺旋-亮氨酸拉鏈(bHLH-zip)轉(zhuǎn)錄因子家族，可調(diào)節(jié)編碼脂質(zhì)生物合成酶的基因表達(dá)，促進(jìn)肝膽固醇和脂肪酸的生物合成[14]。SREBP1在細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞的膽固醇水平改變時(shí)，SREBP1裂解釋放形成轉(zhuǎn)錄因子，并與其他脂代謝基因結(jié)合，組成脂代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控脂質(zhì)代謝[15]。SREBP1表達(dá)失衡可引起血脂代謝紊亂，導(dǎo)致脂肪組織在動(dòng)脈壁的過(guò)度蓄積，可誘發(fā)冠心病[16]。本研究觀察到，THP-1細(xì)胞泡沫化后DNMT1表達(dá)下調(diào)，推測(cè)這一變化可能會(huì)對(duì)細(xì)胞特定基因的甲基化修飾模式產(chǎn)生影響；進(jìn)一步將泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNMT1，檢測(cè)細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的變化發(fā)現(xiàn)，SREBP1基因啟動(dòng)子CpG島特異CG位點(diǎn)發(fā)生甲基化，且該基因mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降，提示脂代謝障礙可能與脂代謝基因的甲基化紊亂有關(guān)。

綜上所述，冠心病發(fā)病機(jī)制中的泡沫細(xì)胞形成可能受到DNA甲基化的調(diào)控，但DNA甲基化參與心血管疾病發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚，在未來(lái)研究中需要更多直接的證據(jù)論證。