MNNG、CDCA構建胃黏膜上皮細胞GES-1腸化生模型的可行性

劉洪，王珅，蔣凱林，黃遠程，李培武，高淑靖，潘靜琳，黃德裕,劉鳳斌

(1廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510405；2廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

萎縮性胃炎和腸上皮化生被認為是胃癌癌前病變(PLGC)[1]。目前關于PLGC的細胞學研究較少，PLGC細胞模型尚未統(tǒng)一，迫切需要構建PLGC細胞的模型標準，以推動抗萎縮性胃炎和腸上皮化生藥物及相關機制的研究。鵝脫氧膽酸(CDCA)是膽鹽的原體，可模擬膽汁反流對胃黏膜的傷害刺激，可用于PLGC動物模型的制備[2]，但鮮見用于復制PLGC細胞模型[3]。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種常見化學誘變劑及致癌劑，可用于模擬硝酸鹽在胃內轉化為亞硝酸胺等致癌物質的過程[4]。2017年3月～2018年1月，本研究分別應用CDCA、MNNG作用于人胃黏膜上皮細胞GES-1，探討二者構建胃黏膜PLGC細胞模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃黏膜上皮細胞GES-1購自中國科學院上海細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：8114273)，F(xiàn)BS(批號：1133067)，0.25%胰酶&0.02%EDTA(批號：13010501)，均購自美國Gibco公司；RNAiso Plus(批號：9109)，5×PrimeScript RT Master Mix(批號：RR360A)，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(批號：RR820A)，均購自TaKaRa公司；CCK-8試劑盒(日本同仁 WST?)；MNNG購自日本東京株式公社，CDCA購自Sigma公司。引物設計合成由Takara公司完成[5]。黏蛋白1(MUC1)-F：TTTCCAGCCCGGGATACCTA，MUC1-R：AGAGGCTGCTG-CCACCATTA；黏蛋白2(MUC2)-F：CGTCTGCAAGT-GCAACACCA，MUC2-R：CTCAGCATTCCCGTGAACACA；尾型同源框轉錄因子2(CDX2)-F：TTCACTACAGTCGCTACATCACCA，CDX2-R：CTGCGGTTC-TGAAACCAGATT；GAPDH-F：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，GAPDH-R：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。

1.2 細胞培養(yǎng) GES-1細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CDCA、MNNG對GES-1細胞10%抑制濃度(IC10)的確定 將GES-1細胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長至約80%融合時傳代，采用胰酶消化成單個細胞，室溫下以1 000 r/min 離心5 min，用培養(yǎng)基吹打混勻，然后按3 000個/孔均勻接種到96孔板中，培養(yǎng)12 h待細胞完全貼壁后更換培養(yǎng)基。分別加入含CDCA、MNNG的完全培養(yǎng)基，CDCA、MNNG起始濃度分別為2.00、640.00 μmol/L，2倍倍比稀釋成7個濃度，每個濃度設6個復孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，450 nm波長下檢測各孔光密度(OD)值。結果顯示，CDCA、MNNG對GES-1細胞均具有抑制作用，CDCA、MNNG對GES-1細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.42、173.79 μmol/L，IC10分別為0.14、51.89 μmol/L。見表1、2。

表1 各濃度CDCA對GES-1細胞的生長抑制作用

表2 各濃度MNNG對GES-1細胞的生長抑制作用

1.4 CDCA、MNNG對GES-1細胞MUC1、MUC2、CDX2 mRNA表達影響的觀察 采用實時熒光定量PCR法。將GES-1細胞以5×104個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h待細胞完全貼壁后更換培養(yǎng)基。將GES-1細胞隨機分為CDCA組、MNNG組，分別加入IC10的CDCA、MNNG，同時設未加藥物處理的細胞為對照組，各組細胞均培養(yǎng)24 h，收集細胞。根據(jù)RNAiso試劑盒說明書提取細胞總RNA，以逆轉錄反應體系合成cDNA。以cDNA為模板用SYBR Green Ⅰ熒光染料進行PCR擴增。以GAPDH為內參基因，反應體系為20 μL，其中2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL，cDNA 2 μL，超純水6.4 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。每個樣本重復3次，取其平均數(shù)為樣本CT值，設定對照組的基因表達量為1，應用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結果

與對照組比較，CDCA組、MNNG組MUC1 mRNA相對表達量均降低，MNNG組MUC2 mRNA相對表達量降低，組間比較P均<0.05。見表3。

表3 三組細胞MUC1、MUC2、CDX2 mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

評價細胞模型復制成功與否的標準大體概括為兩點，一是細胞形態(tài)發(fā)生變化，二是細胞出現(xiàn)特異性蛋白表達。細胞形態(tài)發(fā)生變化主要表現(xiàn)為經(jīng)過MNNG處理后的細胞從初始的梭形，隨傳代的繼續(xù)形態(tài)逐漸變?yōu)椴灰?guī)則，細胞間接觸緊密，呈“島樣”克隆生長，克隆間界限清楚，以梭形細胞環(huán)繞。多數(shù)細胞具有單核，也可出現(xiàn)多核巨大細胞，細胞質內可見空泡[6]。本研究通過鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)CDCA、MNNG刺激后，細胞形態(tài)均呈現(xiàn)長梭形，較正常細胞細長。

消化道MUC是消化道屏障的主要成分，主要由黏膜杯狀細胞分泌，具有潤滑和保護消化道上皮、促進上皮細胞損傷修復的作用[7]。MUC1主要表達于正常胃黏膜，同時在一些腫瘤中也表達[8，9]，也可用于腫瘤的免疫治療[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在正常胃黏膜向腸上皮化生、不典型增生、胃癌演變過程中，MUC1表達率呈下調趨勢[11]。MUC2在正常胃黏膜中不表達，主要表達于十二指腸和空腸，在胃黏膜腸上皮化生或惡化時也會表達[12,13]。CDX2是尾型同源盒基因家族成員，其編碼的蛋白是腸道特異性基因的主要調節(jié)因子，參與細胞分化[14]。CDX2主要通過介導Hox 基因表達維護腸道細胞的正常形態(tài)，在胃腸道的表達僅局限于腸道上皮細胞[15]；在腸型胃癌中，CDX2 蛋白表達可進一步誘導 MUC2 表達[16]；在胃賁門腺癌患者中可能由HP感染導致其上調，誘導炎癥反應[17]；可作為胃黏膜腸上皮化生的標志，其高表達常提示腸上皮化生或惡化[18]。因此，MUC1、MUC2與CDX2可作為正常胃黏膜上皮細胞腸化甚至惡化的特異性觀察指標。

本研究分別采用不同濃度CDCA、MNNG刺激胃黏膜上皮細胞，結果顯示，CDCA、MNNG均可抑制正常胃黏膜細胞生長，提示二者對胃黏膜細胞具有生長抑制作用。選用IC10的CDCA、MNNG刺激GES-1細胞24 h，結果顯示，CDCA組、MNNG組MUC1 mRNA相對表達量均下調，符合PLGC發(fā)病中MUC1的表達變化趨勢[11]。有研究報道，100 μmol/L CDCA刺激GES-1細胞24 h后MUC2 mRNA和蛋白表達上調[19]。本研究結果顯示，CDCA組、MNNG組胃黏膜上皮細胞MUC2 mRNA表達下調，尤其是MNNG組下調明顯。結果產(chǎn)生差異的原因可能與CDCA作用濃度有關，下一步可對不同濃度CDCA刺激GES-1后MUC2的表達變化進行研究。CDCA刺激GES-1后CDX2表達呈現(xiàn)上升趨勢，與既往報道[20]一致。而MNNG刺激后CDX2呈現(xiàn)輕微下降，可能是由于MNNG通過抑制核轉錄因子CDX2表達，從而對GES-1細胞的增殖起到了抑制作用。

綜上所述，CDCA、MNNG可抑制胃黏膜上皮細胞生長；二者通過下調胃特異性基因MUC1表達、上調腸特異性基因CDX2表達模擬胃黏膜腸化生細胞學改變。CDCA及MNNG可用于構建胃黏膜細胞的腸化生模型。