采用特制化學處理劑降解發(fā)酵藥渣中殘留四環(huán)素的研究

卜春苗，陳衛(wèi)民

（1.寧夏大學化學化工學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學環(huán)境工程學院，寧夏銀川 750021）

寧夏地區(qū)由于氣候條件，糧食資源，能源資源非常適合發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。然而排放的大量廢水和廢渣也帶來了環(huán)境的嚴重污染和資源的浪費。如何使這些廢棄物得到無害化處理與有效的循環(huán)利用，是亟待解決的重要問題。但從目前對藥渣的無害化處理與資源利用狀況看，卻存在著嚴重的污染和利用不合理，大部分為禽畜所利用和肥田，少量廢棄直接排入下水，既造成資源的浪費，又污染環(huán)境，同時對食品的安全產生巨大的威脅。由此可見，發(fā)酵藥渣的無害化處理與資源利用已迫在眉睫。

四環(huán)素（tetracycline，TC）發(fā)酵藥渣是以淀粉、葡萄糖、蛋白胨為主要原料作培養(yǎng)基發(fā)酵提取藥物后的副產品，粗蛋白含量在48%以上，是非常有價值的動物蛋白飼料待開發(fā)的原料[1]。但是，原渣中含有微量的四環(huán)素，直接作為蛋白飼料原料利用，會造成動物產品中含有抗生素藥殘，存在食品安全隱患，必須降解處理后才可以利用。

目前，國內外對于環(huán)境水樣中殘留抗生素降解的研究報道較多，常采用的方法有光降解[2]、水解[4]、氧化降解[5]、生物降解[6]、吸附法[7]等。但是，對于抗生素藥渣治理與資源化方面的研究報道較少。

寧夏大學環(huán)境工程學院陳衛(wèi)民課題組，經過多年的努力，研制出一種特殊的化學處理劑：經過脫脂、脫膠、脫臘、脫酸處理的大豆油脂（已獲授權發(fā)明專利，專利號：200610137031.7），提出采用理化復合技術，在確保藥渣固有的營養(yǎng)價值的基礎上實現(xiàn)降解藥渣中殘留四環(huán)素。本文重點考察所研制化學處理劑對四環(huán)素的降解性能，以四環(huán)素生產藥渣為研究對象，驗證對殘留四環(huán)素的降解效果，皆為四環(huán)素廢棄藥渣環(huán)保處理及資源化利用提供新的解決辦法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

LC-20AD液相色譜儀（Shimadzu）；Xevo TQ-S三重四級桿質譜系統(tǒng)；Oasis MCX多功能凈化柱（Waters）；B-400 均質儀（Buchi）；平行樣品濃縮儀（Buchi）；臺式冷凍離心機；超純水儀；漩渦混合器。四環(huán)素標準品（純度≥99%，Sigma）；甲醇、乙腈（色譜純，TEDLA）；乙酸銨（分析純，科密歐有限公司）。

1.2 四環(huán)素測定

1.2.1 配制標準儲備液 稱取25.00 mg四環(huán)素標準物質于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋即得250.00 mg/L，避光保存。

1.2.2 測定條件 色譜柱InertSustain HC-C18（4.6×150 mm，5 μm），檢測波長 355 nm；柱溫 35 ℃；進樣量20 μL；流動相為有機相（乙腈：甲醇=2：1）-水相（0.01 mol/L草酸）=35：65（V/V）；流速：1.0 mL/min。

1.2.3 標準曲線 分別移取250.00 mg/L TC溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 于 50 mL 容量瓶中，甲醇定容得到 10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L 和 50 mg/L 標準溶液，采用HPLC測定標液峰面積，繪制標準曲線，線性方程：y=35 474.26X+70 364.8，R2=0.990 59。

1.3 降解實驗

以25 mg/mL四環(huán)素標準溶液為樣品，分別加入不同劑量的處理劑，在200 r/min攪拌下，不同時間內取樣靜止沉降30 min，于液面下1 cm處取上清液并測定其四環(huán)素含量。四環(huán)素含量采用高效液相色譜法測定，根據標曲計算殘留四環(huán)素含量，計算去除率。四環(huán)素去除率的計算公示如下

式中：C0－四環(huán)素藥渣中初始濃度；Ct－處理后殘留四環(huán)素濃度。

1.4 藥渣降解實驗測定

1.4.1 藥渣樣品降解 藥渣降解實驗在特制的反應容器中進行，在一定量藥渣樣品中加入不同用量的化學處理劑，收集藥渣樣品。

1.4.2 藥渣樣品測定 分別對原渣、降解藥渣樣品經過提取、凈化處理后，后用液相色譜-串聯(lián)質譜（LCMS/MS）分析。提?。悍Q取1.0 g原渣、降解藥渣樣品于50 mL離心管中，分別加入100 μL不同濃度四環(huán)素標準溶液（0.1 mg/mL，0.2mg/mL，0.3 mg/mL，0.4 mg/mL，0.5 mg/mL）和5 mL 4%氯化鈉溶液，充分勻漿后加入5 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取10 min。再加入10 mL乙酸乙酯，振蕩提取5 min，-4℃，12 000 r/min離心5 min，取上層有機相待凈化。凈化：Oasis MCX小柱，依次用3 mL甲醇和3 mL乙酸乙酯活化后，取5.0 mL上層有機相重力過柱，收集溶液。待過柱完成后，用2 mL乙酸乙酯淋洗，再用2 mL甲醇淋洗小柱，后用3 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液。將洗脫液置于氮吹儀上吹干，再用10%甲醇-水溶液定容至1 mL，渦旋30 s，采用0.2 μm GD/Nylon多層針頭式濾器過濾，后采用LC-MS/MS，測定處理藥渣中四環(huán)素殘留量。測試條件：ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫40℃，樣品室溫度20℃，流速0.3 mL/min，進樣體積5.0 μL，流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，每個實驗平行3次，根據測定樣品中四環(huán)素殘留量，計算去除效率（見表1）。

表1 以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相梯度洗脫程序

2 實驗結果與討論

2.1 不同處理劑用量對TC降解的影響

實驗采用不同處理劑用量對250 mg/L TC溶液降解2 h，處理劑用量相對于TC的質量分數(shù)為：2%，4%，6%，8%和10%，處理劑用量對四環(huán)素的去除效果（見圖 1）。

圖1 處理劑用量對四環(huán)素降解率的影響

由圖1可知，當體系中TC濃度為56 μm，降解時間為2 h時，加入2%處理劑的量，TC降解率為44.86%，隨著處理劑用量的增加，TC去除率呈現(xiàn)上升趨勢，當處理劑增加至8%時，TC去除率為74.8%，但隨著處理劑用量的繼續(xù)增加，TC的去除率基本保持不變。

2.2 時間對TC降解的影響

繼續(xù)探討降解時間對TC去除率的影響，分別對56 μm的TC溶液加入不同處理劑用量，考察在降解時間為：0.5 h，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，7 h，8 h，9 h，10 h，11 h，12 h下處理劑對TC的去除效果，結果（見圖2），結果顯示，在不同處理劑用量下，隨著降解時間的延長，TC的去除率逐漸上升，當降解時間為10 h時，在不同處理劑用量下，TC的去除率都達到最大值，而隨著時間的繼續(xù)增長，TC去除率基本保持不變。在2%，4%，6%，8%和10%處理劑用量下，TC的去除率最大分別能達到：52.64%、65.4%、77.03%、97.00%、95.98%，結果證明，10 h的降解時間，8%的處理劑用量，TC的去除效果最優(yōu)。

3 用于藥渣實際樣品中四環(huán)素的去除

3.1 藥渣樣品中殘留四環(huán)素的檢測

進一步驗證處理劑對實際藥渣樣品的處理能力。在1.0 g藥渣樣品中加入20%、25%和30%（W/W）的特制處理劑，降解時間10 h，將降解藥渣樣品經提取、凈化處理后，提取液通過LC-MS/MS檢測，采用空白基質加標定量方法，對降解藥渣中四環(huán)素含量進行測定。四環(huán)素標液，原藥渣和藥渣降解后陽性樣品的對照譜圖（見圖3），可以看出，與原藥渣樣品譜圖進行對比，降解藥渣中四環(huán)素的峰明顯降低，證明處理劑具有去除藥渣中四環(huán)素的能力。

圖2 處理時間對四環(huán)素降解率的影響

3.2 藥渣樣品中四環(huán)素的去除

藥渣本身四環(huán)素的含量較高（225 μm～338 μm），根據2.1中考察處理劑用量與四環(huán)素去除率間的關系，在藥渣樣品中分別加入相對于藥渣樣品：20%、25%和30%（W/W）的處理劑量，測定藥渣中四環(huán)素的去除率，結果（見表2），加入20%、25%和 30%（W/W）的化學處理劑，降解10 h后，25%和30%的降解率為81.8%和82%，結果證明采用25%的化學處理試劑，能最大去除藥渣中四環(huán)素的殘留量。也表明，當處理劑應用于實際樣品藥渣中，由于體系的復雜性，與單一的四環(huán)素溶液相比，四環(huán)素的去除量稍有降低。

表2 化學處理試劑用量對藥渣中四環(huán)素的去除

圖3 標準四環(huán)素溶液、原渣和降解藥渣中陽性樣品的LC-MS/MS譜圖

3.3 化學處理-紫外光協(xié)助降解藥渣樣品中的四環(huán)素

圖4 紫外照射時間對四環(huán)素降解的影響

光降解是降解四環(huán)素的一種重要途徑。為了進一步提高藥渣中四環(huán)素的降解效果，擬采用光降解和化學處理劑相結合的方法，驗證對四環(huán)素的降解性能。研究已經證實254 nm紫外光照射對四環(huán)素具有較強的光解作用[5]，本文在加入25%的特制化學處理劑條件下，采用254 nm紫外光照射，分別測定0 h，5 h，10 h，15 h光照時間下藥渣中四環(huán)素的殘留量，計算去除率。結果（見圖4），隨著光照射時間的延長，四環(huán)素的降解率由81.8%提高到91%，實現(xiàn)了進一步提高四環(huán)素降解效果的目的，表明本文采用的化學處理-紫外光降解的方式在去除藥渣中殘留四環(huán)素方面具有潛在的應用價值。

4 結論

本文以降解藥渣中殘留四環(huán)素為目標，采用特制化學處理劑：大豆卵油脂，并結合254 nm紫外光照射相結合的方式，探討對四環(huán)素的降解性能，結果表明：

（1）采用特制化學處理劑（自制大豆卵油脂），8%的處理劑用量（W/W，相對于四環(huán)素），10 h下，可降解53 μm的四環(huán)素。

（2）將其用于四環(huán)素藥渣原樣中四環(huán)素的去除，加入25%的化學處理劑（W/W，相對于藥渣樣品），降解10 h，四環(huán)素的去除率最大能達到81.8%。

（3）為了進一步提高四環(huán)素的降解率，采用化學處理和紫外光降解相結合的方式。結果顯示，在20%的化學處理劑用量下，254 nm下采用紫外光照射，藥渣中四環(huán)素的降解率高達91%，高于目前文獻報道值，證明本文方法在降解四環(huán)素殘留中具有潛力。