羊源雷氏普羅威斯登菌的分離鑒定

曹瑞勇，聶 鑫，李國(guó)華，杜 麗，王鳳陽(yáng)

（海南大學(xué)，海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海口市動(dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228）

普羅威登斯菌（Providencia spp）是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科。包括產(chǎn)堿普羅維斯登菌（P.alcalifaciens）、雷氏普羅威登斯菌（P.rettgeri）、拉氏普羅威登斯菌（P.rustigianii）和斯氏普羅威登斯菌（P.stuartii）[1-2]。該菌是一種條件致病性的人畜共患病原菌，能引起腹瀉、腸道外感染和尿道感染等疾病[3]。也屬于人畜共患病病原，是可以污染食物造成中毒的食物伴侶菌，并且極易產(chǎn)生耐藥性[4]。Williams G J等[5]曾從鱷魚巨蜥的肺組織中分離到雷氏普羅威登斯菌；2017年芮萍等[6]對(duì)臨床表現(xiàn)為腹瀉仔豬，進(jìn)行致病菌的分離鑒定，結(jié)果表明：該病原菌為雷氏普羅維登斯，并且耐藥廣泛。

本文從海南某黑山羊養(yǎng)殖場(chǎng)患病山羊鼻腔內(nèi)分離到了該菌，為海南黑山羊疾病的診斷和治療奠基了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 海南省某黑山羊養(yǎng)殖場(chǎng)黑山羊鼻腔分泌液。

1.2 主要試劑TSA、TSB培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、生化鑒定管和生化鑒定試紙，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物有限公司；DNA回收純化試劑盒，購(gòu)自Takara寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR MasterMix，D2000 marker，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病料采集采集于海南某黑山羊養(yǎng)殖場(chǎng)病羊鼻拭子。病料采集前用75%酒精徹底消毒病羊的鼻孔周圍，用一次性無(wú)菌棉簽在鼻孔深處再次旋轉(zhuǎn)以蘸取鼻腔分泌液，將棉簽折斷放于無(wú)菌試管中，于4℃保存，以備試驗(yàn)處理。

1.3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將采集的鼻拭子，放于無(wú)菌的生理鹽水中，37℃劇烈震蕩30 min，吸取0.2 mL加入到TSB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后作為增菌液。吸取適量的增菌液，做革蘭氏染色。將增菌液接種于麥康凱培養(yǎng)基和TSA，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。在平板上挑取形態(tài)一致、優(yōu)勢(shì)的菌落，進(jìn)行反復(fù)劃線數(shù)次，純化菌株。再挑取單個(gè)菌落經(jīng)革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)及染色特點(diǎn)。

1.3.3 生化反應(yīng)特性參照姚火春等[7-8]的方法進(jìn)行生化反應(yīng)試驗(yàn)，參照試劑盒說(shuō)明書操作后，在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，結(jié)果見表1。

1.3.416 S rRAN鑒定采用菌落PCR方法，用崔穎鵬等[9]設(shè)計(jì)的引物序列，為1 465 bp。

表1 引物序列Table 1Primer sequence

在離心管中加入300 μL無(wú)菌水，接種環(huán)菌苔至管中，振蕩，沸水浴10 min，10 000 g離心5 min，取上清為模板[10]，PCR擴(kuò)增16S rDNA，反應(yīng)體系：10×Buffe 2.5 μL，dNTP各1 mmoL，Taq聚合酶1.5 U，上下游引物各 0.5 μL（0.2 μmoL），細(xì)菌DNA模板0.5 μL，加蒸水至25 μL；反應(yīng)條件：94℃4 min預(yù)變性；94℃45 s、55℃45 s、72℃1 min，循環(huán)30次，72℃10 min修復(fù)延伸[11]。用凝膠成儀拍照保存。

2 結(jié)果和分析

2.1 細(xì)菌分析情況和革蘭染色鏡檢結(jié)果在TSA平板上菌落呈表面光滑、邊緣整齊的無(wú)色半透明圓形菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上形成淺橙色菌落。挑取單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色，用油鏡觀察。觀察結(jié)果：革蘭氏陰性、兩端鈍圓、球桿菌（如圖1）。

圖1 分離菌株的革蘭氏染色Fig.1Gram stain of the isolated strain

2.2 生化鑒定結(jié)果將分離菌株按照生化鑒定管說(shuō)明書操作完成，結(jié)果如表2。

表2 生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果Table 2Biochemical identification results

2.316 SrRAN鑒定結(jié)果與鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物大小為1 465 bp，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。紫外燈下觀察結(jié)果和試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致（如圖2）。

按照DNA回收純化試劑盒方法回收純化陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Nucleotide BLAST，與雷氏普羅威登斯菌（KC456547.1）同源性達(dá)到99%。

圖2 16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification product of 16S rRNA

3 討論

雷氏普羅威登菌（Providencia rettgeri）是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌。在人上主要可致泌尿道感染和其他的腸道外感染。2006年衛(wèi)生部把它列入人與人間傳染的病原微生物名錄。根據(jù)報(bào)道，食物在加工、運(yùn)輸、銷售過(guò)程中很容易受該菌污染，引起食物中毒事件多有發(fā)生。本菌為腐敗菌，耐低溫，可以在低溫儲(chǔ)存的食品中存活，尤其是夏季天氣炎熱更易造成該菌的大量繁殖，造成食物腐敗，人在食用該菌污染的食物后會(huì)出現(xiàn)食物中毒現(xiàn)象，國(guó)內(nèi)報(bào)道，從肉類食品中分離到的雷氏普羅威登斯菌可能沿著食物鏈向人類傳播，給人類生命安全造成很大威脅[12]。雷氏普羅威登菌是一種條件致病菌，可引起人和動(dòng)物發(fā)病。1997年戰(zhàn)文斌等[7]首次從國(guó)內(nèi)發(fā)病的對(duì)蝦中分離出該菌，并在實(shí)驗(yàn)室人工感染對(duì)蝦成功，說(shuō)明該菌對(duì)海水養(yǎng)殖動(dòng)物有致病性。2001年，范紅結(jié)等[13]從病鱉干酪樣壞死的臟器中分離到雷氏普羅威登菌，用該菌接種健康鱉，引起發(fā)病死亡，證實(shí)該菌有致病性。

本試驗(yàn)在臨床中通過(guò)對(duì)細(xì)菌的分離培養(yǎng)、細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，最終確定分離菌株為雷氏普羅威登斯菌。該菌可能因?yàn)樘鞖馔蝗蛔兓?、?dòng)物免疫力下降等原因感染動(dòng)物，為臨床疾病治療提供了參考資料。為臨床患呼吸道疾病、敗血癥、尿道感染、混合感染病羊的治療提供了新的思路和方案，也給養(yǎng)殖人員敲響了人畜共患疾病風(fēng)險(xiǎn)的警鐘。