豆類植物接種微生物對土壤DEHP的降解效果研究

何詩琳 謝方文

摘要：鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是使用最廣和產(chǎn)量最大的塑化劑，屬于內(nèi)分泌干擾物，具有致癌、致畸、致突變的“三致”效應(yīng)。隨著DEHP的廣泛應(yīng)用，土壤和水體已經(jīng)受到了不同程度的污染。如何有效修復(fù)受DEHP等鄰苯二甲酸酯化合物（Phthalic Acid Esters，PAEs）污染的土壤已成為當(dāng)前研究的熱點之一。在此背景下，本文采用黃豆（Glycine max）與芽孢桿菌（Bacillus sp1）（DW）、革登氏菌（Gordona sp1）（DH）聯(lián)合，通過盆栽實驗研究土壤中DEHP的殘留狀態(tài)，并探討豆類植物接種微生物對DEHP降解的影響，以期為植物-微生物聯(lián)合修復(fù)DEHP污染土壤提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯；植物-微生物聯(lián)合修復(fù)；有機物污染土壤

中圖分類號：X131.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-672X（2018）05-0120-02

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.05.071

Abstract： Di-（2-ethylhexyl）phthalate （DEHP） is the most widely used and most powerful plasticizer. It belongs to endocrine disruptors and has carcinogenic and teratogenic effects. Mutagenic “triple” effect. With the widespread use of DEHP， soil and water have been polluted to varying degrees. The restoration of contaminated soils such as DEHP and other Phthalic Acid Esters （PAEs） has become one of the current research hotspots. In this study， soybean （Glycine max） was combined with Bacillus sp1 （DW） and Gordona sp1 （DH） to study the residual status of DEHP in soil by pot experiment to investigate the inoculation of legumes on legumes. The effect of DEHP degradation provided a scientific basis for plant-microorganism combined repair of DEHP-contaminated soil.

Key words： Di（2-ethylhexyl） phthalate； Plant-microorganism combined repair； Organic matter contaminated soil

DEHP是目前世界上生產(chǎn)量大、應(yīng)用面較廣的人工合成有機化合物之一。因其能夠改善塑料產(chǎn)品的柔軟性和耐寒性，增大產(chǎn)品的可塑性，提高產(chǎn)品的強度，而被作為增塑劑，被廣泛應(yīng)用于食品包裝材料、容器、醫(yī)療用品、建筑產(chǎn)品、衣物以及人造革等領(lǐng)域[1]。

但DEHP在使用過程中也存在用量大、毒性高、降解難等突出的環(huán)保問題，且DEHP屬內(nèi)分泌干擾物，其具有致癌、致畸、致突變的“三致”效應(yīng)。此外，DEHP還可對人類基因的表達(dá)有重要影響，并且在適當(dāng)濃度下它可能影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育從而導(dǎo)致出生缺陷[2]。在土壤中，高濃度DEHP對測試生物都產(chǎn)生了一定程度的危害，反過來，土壤生物（主要是細(xì)菌）可富集或降解DEHP，降解作用只有在DEHP濃度較低時，才很明顯[3]。農(nóng)業(yè)土壤中，DEHP施加量達(dá)100mg/kg時顯著抑制了土壤脫氫酶活性，導(dǎo)致了土壤為生物群落功能多樣性的下降。DEHP還能使植物生長緩慢，減少產(chǎn)量，影響作物品質(zhì)，作物對土壤中DEHP還有一定的吸收累積效應(yīng)，從而對人體健康構(gòu)成威脅[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗材料：本實驗供試作物包括黃豆（Glycine max）、DEHP高效降解菌株芽孢桿菌Bacillus sp1 （DW） 和革登氏菌Gordona sp1（DH）。

試驗用土壤：采自水稻土耕作層（0-20cm），風(fēng)干、磨碎后過5.0mm篩備用，配置污染土所需土樣過1.0mm銅篩。

1.2 植物-微生物聯(lián)合降解研究

1.2.1 污染土壤的制備

取適量過1.0mm銅篩的土壤，分層淋入DEHP儲備液，使其濃度達(dá)到500mg/kg，置于陰涼處并翻動3-5遍以使DEHP混合均勻。待丙酮揮發(fā)完全后，取適量過5.0mm銅篩的土壤與上述污染土混合制成濃度為50mg/kg的污染土壤，同時混入預(yù)先準(zhǔn)備好的尿素、磷酸二氫鉀、氯化鉀（用量為N：0.20g/kg土，P：0.15g/kg土，K：0.20g/kg土），裝到干凈瓷盆中，每盆裝土5kg。向裝填好的瓷盆中每盆添加500mL蒸餾水，使其持水量保持在30%～40%。盆栽前，空白土壤和人工配置的污染土壤PAEs含量水平分別為0.372mg/kg（干重）和 50.435 mg/kg（干重）。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)與保存

采用LB培養(yǎng)基（蛋白胨，10g/L；酵母，5g/L；氯化鈉，5g/L；蒸餾水，1L）將保存在斜面中的DW1和DH3轉(zhuǎn)接到平板和斜面，再將分離無雜菌的DW1和DH3分別保存到甘油管，另一部分以斜面保存。

接種菌株DW和DH于100mL 富集培養(yǎng)基 （3g/L牛肉膏、5g/L蛋白胨、5g/L NaCl、pH 7.0） 中，121℃濕熱滅菌30min，30℃振蕩培養(yǎng)48h，10000r/min離心5min， 收集菌體，0.1mol/L的MgSO4·7H2O洗滌菌體3次，最后用0.1mol/L的MgSO4·7H2O將菌體懸浮，測定細(xì)菌懸液的光密度（λ=600nm） 并調(diào)整至密度約為1012個/mL。

1.2.3 盆栽實驗方法

室內(nèi)人工配置一定濃度DEHP污染土壤（50mg/kg），設(shè)置土壤接種DW、DH、DW+DH（1：1）以及不接種降解菌的對照（CK）共4個處理。

播種時，在瓷盆中挖一個深約2cm的圓環(huán)，均勻撒入6-10顆種子，將50mL菌液緩慢均勻地噴淋在圓環(huán)內(nèi)外兩側(cè)，最后澆水兩次。設(shè)置不種植豆類的空白土壤（分別接種DW、DH、DW+DH（1：1）以及不接種降解菌）。

分別于不同時間采集土壤（15d、25d、40d、60d）和豆類（60d）樣品，測定樣品中DEHP含量。

1.2.4 樣品預(yù)處理流程

樣品預(yù)處理采用超聲波提取法。提取液在特定溫度下采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5mL左右，采用三氧化二鋁-硅膠-無水硫酸鈉層析柱凈化分離，用約40mL的二氯甲苯進(jìn)行洗脫。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至<0.5mL，轉(zhuǎn)移至棕色樣品瓶（2.0mL），用GC-MS測定。

2 結(jié)果分析

土壤-豆類-菌株系統(tǒng)中DEHP的殘留特征：

根據(jù)圖1，DEHP污染水平相同的情況下，無論是否接種豆類，土壤DEHP殘留含量與栽種時間呈負(fù)相關(guān)，隨著栽種時間的延長，土壤DEHP含量均有一定程度下降。在前15d內(nèi)，DEHP的降解速率較慢；在15～40d的時間段內(nèi)，DEHP的降解速率較快；40d之后，其降解速率趨于緩慢。不種植豆類的空白土壤DEHP降解速度呈勻速狀態(tài)，平穩(wěn)而且緩慢。在50d后，空白土壤比種植黃豆的土壤DEHP殘留濃度更低，說明豆類在短時間內(nèi)是會促進(jìn)DEHP降解，50d以后，豆類對DEHP的吸收有可能對DEHP酶促降解產(chǎn)生影響。

根據(jù)圖2，所有的接種處理，無論是單獨接種或是聯(lián)合接種，與對照相比，均明顯降低了土壤中DEHP含量，影響從大到小依次是DH+DW>DH>DW；菌株-黃豆聯(lián)合種植土壤DEHP殘留濃度更低，說明黃豆的種植對于DEHP的降解有一定的促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

（1）土壤-豆類-菌株系統(tǒng)中，土壤中DEHP含量隨著時間增加而下降，在前15d內(nèi)，DEHP的降解速率最慢，在15～40d的時間段內(nèi)，DEHP的降解速率最快，40d之后，降解速率趨于緩慢。

（2）土壤中接種菌株后，DEHP降解能力增強，革登氏菌對DEHP降解能力大于芽孢桿菌，聯(lián)合接種比單一接種降解能力更強。豆類植物在快速生長期（約50d內(nèi)）對菌株降解DEHP有促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]謝沁珊，王杉杉，蔡鳳云等.塑料增塑劑DEHP環(huán)境污染水平、人體負(fù)荷及生物毒性的初步研究[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，5（21）：19-22.

[2]Svechnikova I， Svechnikov K， Soder O. The influence of di-（2-ethylhexyl） phthalate on steroidogenesis by the ovarian granulosa cells of immature femals rats[J].Journal of Endocrinology，2007，194（3）：603-609.

[3]陳強，孫紅文，王兵等.鄰苯二甲酸二異辛酯（DEHP）對土壤中微生物和動物的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2004，23（6）：1156-1159.

[4]曾巧云，莫測輝，蔡全英.農(nóng)業(yè)土壤中鄰苯二甲酸酯的污染現(xiàn)狀與危害[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（7）：90-96.

收稿日期：2018-04-06

作者簡介：何詩琳（1990-），女，現(xiàn)工作于北京建工環(huán)境修復(fù)股份有限公司，助理工程師，研究方向為污染場地修復(fù)。