八味大青葉洗劑質量標準研究

程洪兵，李寒冰，張躍文，趙永旗*，韓石蕊，邵海榮，郭社民

（1.濮陽市人民醫(yī)院，河南 濮陽 457000；2.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450046；3.濮陽市食品藥品檢驗檢測中心，河南 濮陽 457000）

八味大青葉洗劑是本院應用多年的協(xié)定處方制劑，由大青葉、蛇床子、苦參、地膚子等8味中藥經(jīng)水提、醇提、濃縮等工藝制備而成的外用洗劑，八味大青葉洗劑可發(fā)揮清熱及解毒、燥濕和止癢的作用。為更好地控制藥品質量，采用薄層色譜鑒別（TLC）[1]補充并改進了本制劑中大青葉、苦參、地膚子、金銀花等4味藥材的定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）[1]對君藥蛇床子中所含蛇床子素進行了含量測定研究，實驗結果表明，本方法操作簡便可靠，靈敏度高，可有效控制八味大青葉洗劑的質量。

1　材料

Waters 515高效液相色譜儀；Precisa電子天平（型號：92SM-202A）；紫外可見分光光度計（型號：L6）；三用紫外儀（型號：ZF-2）；硅膠G薄層板（10 cm×20 cm，北京恒業(yè)中遠化工有限公司）；2%氫氧化鈉溶液-硅膠G薄層板（10 cm×20 cm，自制）；聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。大青葉的對照藥材、苦參的對照藥材、金銀花的對照藥材、地膚子皂苷Ic的對照品、蛇床子素對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號分別為：121367-200401，121019-200304，121060-200504，111723-200602，110822-200406）；八味大青葉洗劑（批號分別為170306，170328，170410，170421）及陰性樣品均由濮陽市人民醫(yī)院制劑室提供；甲醇、乙腈為色譜純；苯、甲苯、醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙酸、乙醇、無水乙醇、氫氧化鈉、碘化鉍鉀、濃氨水、亞硝酸鈉等均為分析純；薄層層析硅膠G（60型，中國青島海洋化工集團公司）為化學純；水為注射用水。

2　方法與結果

2.1定性鑒別[2-8]

2.1.1大青葉薄層色譜鑒別 取本品10 mL，加1%鹽酸調pH值至2～3，置分液漏斗中，加三氯甲烷振搖提取3次，每次提取10 mL，將三氯甲烷液進行合并，之后揮干，對剩余的殘渣加入1 mL的三氯甲烷，使殘渣溶解，將其作為供試品的溶液。對缺大青葉的相關陰性樣品、陰性的對照溶液進行制備。并取大青葉的對照藥材共1.2 g，加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，給予濾過，將濾液進行濃縮到1 mL，將其作為對照的藥材溶液。對以上3種溶液均分別吸取10 μL，點在同一個硅膠G薄層板的上面，將苯-三氯甲烷-丙酮（5：4：1）作為展開劑，展開并晾干之后，于日光下進行檢視。供試品的相關色譜中，在和對照藥材的色譜所對應的位置上，顯出相同顏色的相關斑點，陰性的對照溶液則沒有出現(xiàn)相關斑點，見圖1A（插頁二）。

2.1.2苦參薄層色譜的鑒別 取得10 mL的本品，加入濃氨試液調節(jié)其pH值到堿性，加入三氯甲烷進行振搖并進行3次提取，每次加入10 mL，將三氯甲烷液進行合并，之后揮干，對剩余的殘渣加入0.5 mL的三氯甲烷，使殘渣溶解，將其作為供試品的溶液。對缺苦參的相關陰性樣品、陰性的對照溶液進行制備。并取苦參的對照藥材的粉末共1.2 g，加入25 mL的三氯甲烷、0.3 mL的濃氨試液，于超聲下30 min，給予濾過，將濾液進行揮干，剩余的殘渣加入0.5 mL三氯甲烷，使殘渣溶解，將其作為對照的藥材溶液。對以上3種溶液均分別吸取10 μL，點在同一個2%的氫氧化鈉溶液-硅膠G薄層板的上面，將苯-丙酮-甲醇（8：3：0.5）作為展開劑，展開并晾干之后，將甲苯-醋酸乙酯-甲醇-水（2：4：2：1）在低于10℃放置之后的上層溶液作為展開劑，展開并晾干之后，噴上碘化鉍鉀試液以及亞硝酸鈉乙醇試液。在供試品的色譜中，在和對照藥材的色譜所對應的位置上，顯出相同顏色的相關斑點，陰性的對照溶液則沒有出現(xiàn)相關斑點，見圖1B（插頁二）。

2.1.3地膚子薄層色譜的鑒別 取得本品共20 mL，加丙酮30 mL振搖，過濾，收集續(xù)濾液備用；取續(xù)濾液15 mL，置水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。按樣品的制備工藝制備缺地膚子的陰性的樣品，并對陰性的對照溶液進行指標。取地膚子皂苷Ic的對照品，加入甲醇制備每l mL含有0.5 mg的溶液，將其作為對照品的溶液。對以上3種溶液均分別吸取5 μL，點在同一個硅膠G薄層板的上面，將三氯甲烷-甲醇-水（16：9：2）作為展開劑，展開并晾干之后，噴上10%的硫酸乙醇溶液，使用熱風吹到斑點的顯色比較清晰。供試品的色譜中，在和對照品的色譜所對應的位置上，顯出相同的紫紅色的斑點，陰性的對照溶液則沒有出現(xiàn)相關斑點，見圖1C（插頁二）。

2.1.4金銀花薄層色譜鑒別 取2.1.3項續(xù)濾液5 mL，置水浴蒸干，殘渣加入2 mL的甲醇使之得到溶解，將其作為供試品的溶液。對缺金銀花的陰性樣品、陰性的對照溶液進行制備。取得金銀花的對照藥材共0.2 g，加入5 mL的甲醇，給予30 min超聲處理，給予濾過，將濾液作為對照的藥材溶液。對以上3種溶液均分別吸取10 μL，點在同一個聚酰胺薄膜的上面，使用42%的乙酸溶液作為展開劑，展開并晾干之后，放于紫外光燈（365 nm）下面進行檢視。供試品的色譜中，在和對照藥材的色譜所對應的位置上，顯出相同的顏色的相關熒光斑點，陰性的對照溶液則沒有出現(xiàn)相關斑點，見圖1D（插頁二）。

2.2蛇床子素含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：WelchromC18色譜柱（ 250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相為：乙腈-水（比例為65：35）；檢測波長322 nm；流速為1.0 mL/min；理論板數(shù)按蛇床子素計算應不低于3 000。在該條件下測定，陰性對照無干擾，見圖2（插頁二）。

2.2.2溶液的制備 取適量的蛇床子素的對照品，加如乙醇制備每1 mL含有1402.0 μg的溶液，作為儲備液。取儲備溶液1 mL置10 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密的量取5 mL的八味大青葉洗劑，放在50 mL的量瓶內，加入無水乙醇到刻度，給予搖勻和濾過，得到供試品的溶液 。將相同比例的處方內不含有蛇床子的其它藥材進行陰性樣品的制備，并對陰性的對照溶液進行制備。

2.2.3線性關系的相關考察 準確量取對照品儲備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。吸取20 μL注入液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件測定峰面積。以蛇床子素面積積分值（Y）為縱坐標，蛇床子素進樣濃度（X，μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝39 439 X＋148 877 ，r = 0.999 8（n = 6）。結果表明，蛇床子素進樣濃度在56～280 μg/mL范圍之內，濃度和峰面積顯示比較良好的線性關系。

2.2.4精密度以及穩(wěn)定性的試驗 準確量取同一個對照品的溶液20 μL，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積。以峰面積計算，RSD為 0.95%（n = 6），表明方法精密度良好。室溫放置，于0，1，2，4，8，12 h分別進樣，記錄峰面積基本不變，RSD為0.98%，表明供試品溶液至少在12 h內穩(wěn)定。

2.2.5重復性實驗 分別精密量取八味大青葉洗劑（批號170328）6份，按2.2.2項下方法制備供試品的溶液且進行進樣，對峰面積進行測定，對樣品中的蛇床子素的平均含量進行計算得到的值為1 624.8 μg/mL，RSD為1.10%（n = 6），表明方法重復性良好。

2.2.6加樣回收率試驗 精密量取八味大青葉洗劑（批號170328，蛇床子素濃度1 624.8 μg/mL）6.0，4.0，2.0 mL三個梯度各2份，分別置100 mL量瓶中；再分別對應依次精密加入蛇床子素對照品儲備液（1 402.0 μg/mL）4.0，8.0，12.0 mL各2份置上述100 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過，制得六份供試溶液。取供試溶液各20 μL，依次注入液相色譜儀，按2.2.1 項下色譜條件 測定蛇床子素含量，計算回收率。供試溶液中的蛇床子素含量以濃度單位表示，結果見表1。

2.2.7樣品含量測定 取3批供試品（批號：170306，170410，170421），依照2.2.2項下方法制備3份供試品的溶液，根據(jù)2.2.1中的色譜條件進行進樣，對峰面積進行記錄，根據(jù)外標法進行含量計算，所得到的結果如表2。

表1　蛇床子素回收率實驗結果

表2　八味大青葉洗劑中的蛇床子素的含量的測定結果

3　討論

八味大青葉洗劑中除了含有以上檢測的5種藥材外，還含有蒼術、萊菔子、紫花地丁等3種藥材。本制劑原質量標準中僅有大青葉和苦參的薄層鑒別項，現(xiàn)增加了地膚子、金銀花的薄層鑒別項，完善了大青葉、苦參的薄層鑒別。金銀花薄層鑒別中，曾選用硅膠G的薄層板、硅膠H的薄層板和乙酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）的上層溶液作為展開劑的試驗，效果均不理想；考慮到金銀花中含有較多的黃酮類如木樨草黃素、有機酸類如綠原酸、揮發(fā)油類如芳樟醇等[9]，而聚酰胺薄膜分離上述化學成分有較好的效果，故選用聚酰胺薄膜，以乙酸為展開劑進行展開，并對比試驗了乙酸的3種不同濃度（42%，36%，30%），結果顯示，選用42%乙酸分離效果最理想，且斑點清晰。八味大青葉洗劑之君藥蛇床子，為傘形科植物蛇床的干燥成熟果實，味辛、苦、溫，具有溫腎壯陽，燥濕，祛風，殺蟲等作用。蛇床子含有香豆素類化合物如蛇床子素、歐前胡腦等和揮發(fā)油如蒎烯、異戊酸龍腦酯等[10]，《中國藥典》2015年版1部對蛇床子中蛇床子素的含量進行了規(guī)定。本制劑原質量標準無含量測定項，現(xiàn)選擇蛇床子中含量較高的蛇床子素作為含量控制項，能側面反映本制劑的制備狀況，有助于控制制劑質量。配制蛇床子素對照品溶液，作紫外光譜掃描，在322 nm處有最大吸收，故選取322 nm為檢測波長。參考文獻報道[11-15]筆者對本制劑供試品制備、流動相選擇、檢驗方法學等方面做了系列研究，結果為文中所述條件最優(yōu)，結果理想。根據(jù)八味大青葉洗劑本次含量測定的結果及平時實際配制的測定情況，確定八味大青葉洗劑中所含蛇床子素每1 mL不得少于1.0 mg。為更好控制藥品質量，今后有待進一步開展八味大青葉洗劑中，其他藥材薄層色譜鑒別及有效成分含量測定等方面的方法學研究。