鋅對神經(jīng)病理性疼痛小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及海馬DG區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白表達的影響

張海燕 王月靜 姚宏波 廉 潔 孫麗慧

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組胚教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

神經(jīng)病理性疼痛(NPP)是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或產(chǎn)生病變而導(dǎo)致的一種慢性疼痛。盡管病因未明，一項針對 275例慢性持續(xù)性疼痛患者的認知功能的研究表明，有超過半數(shù)的受試者(54%)出現(xiàn)一種以上的認知功能問題，主要癥狀為難以集中注意力、解決問題和推理能力差、精神錯亂、定向力障礙及反應(yīng)時間長〔1〕。另一項臨床研究同樣表明，慢性疼痛可能使注意力下降，妨礙記憶的過程〔2〕。動物海馬組織與學(xué)習(xí)記憶及認知功能密切相關(guān)，對內(nèi)源性或外源性環(huán)境因素(如高齡、慢性應(yīng)激等)刺激很敏感，當機體接受慢性應(yīng)激刺激時，海馬結(jié)構(gòu)會被損害進而使其學(xué)習(xí)記憶能力減退〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)當動物模型產(chǎn)生NPP時，機體可因為慢性應(yīng)激而引起相應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶能力下降〔4〕。鋅是我們體內(nèi)所必需的微量元素，在腦組織中海馬的突觸泡和苔蘚纖維鋅含量最高，而該部位與動物的學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)缺鋅動物模型的學(xué)習(xí)記憶和生長發(fā)育顯著下降〔6〕。本實驗通過在NPP動物模型中添加飼料鋅，觀察其對NPP所致學(xué)習(xí)記憶障礙的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 32只雄性健康C57/BL6小鼠(室溫飼養(yǎng)，正常飲食水)，體重(23±2)g，齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(黑)2006-0010。

1.2主要試劑 硫酸鋅 (福州邁新)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)抗體(Santa公司)，免疫組化試劑盒、甲基紫染色劑，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(福州邁新)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜和蛋白Marker (NEB公司)，戊巴比妥鈉、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒和膠片(Santa公司)，多聚甲醛和酒精等(福州邁新)。

1.3實驗器材 1/10 000電子分析天平(上海)；JY-ECP3000電泳儀(北京)；Olympus萬能顯微鏡和照相機(日本)；臺式高速離心機(上海)；-80℃超低溫冰箱(日本)；超聲波細胞粉碎機(中國)；MIVNT顯微圖像分析系統(tǒng)(中國)；半干轉(zhuǎn)印電泳槽 (大連)；Mikro22R高速冷凍離心機(德國)；低溫離心機(北京)；電轉(zhuǎn)移槽(北京)；化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀(上海)。

1.4實驗方法

1.4.1NPP小鼠模型制備 首先制作L5-SNT模型，以2%戊巴比妥(50 mg/kg)注射到C57/BL6小鼠腹腔，待其麻醉后，在小鼠背部L4-S1椎體處切開，將左側(cè)椎旁肌肉鈍性分離，將L6橫突和L5椎板去除，將臨近背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)結(jié)扎，割斷神經(jīng)遠端，縫合切口。假手術(shù)組切開皮膚分離左側(cè)椎旁肌肉后，只將L6橫突及L5椎板去除，神經(jīng)保留。

1.4.3Morris水迷宮實驗 各組模型制備后29 d時行Morris水迷宮實驗。實驗總時間為5 d，每天9∶00至13∶00 進行訓(xùn)練。隱藏平臺潛伏期實驗在前4 d進行，隨機將動物從非平臺所在象限的3個入水點面向池壁放入水中，計算機軟件記錄動物在60 s內(nèi)尋找并爬上平臺的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在60 s內(nèi)仍未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺并停留15 s，潛伏期計為60 s。第5天為空間探索實驗，將動物放入水中自由游泳，記錄60 s內(nèi)在原平臺所在象限的游泳時間和路徑，分別計算在原平臺所在象限游泳時間與路徑與總游泳時間和總路徑的比值。

1.4.4取材與標本制備 實驗結(jié)束后，4%硫噴妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉各組小鼠，各組小鼠斷頭取海馬組織，一部分放入-80℃冰箱保存，用于Western印跡實驗；取另一部分用4%多聚甲醛固定12 h，經(jīng)石蠟包埋后，制備5 μm厚的石蠟切片。

1.4.5免疫組化檢測 石蠟組織切片后，常規(guī)脫蠟及水化，高壓修復(fù)1.5 min。之后滴加3%的過氧化氫10 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，加入5%BSA封閉30 min，將其去除后放兔抗小鼠多克隆BDNF抗體 (1∶200)及CREB抗體(1∶800)，4℃冰箱過夜；次日室溫下放置1 h，PBS沖洗后加入二抗(鼠抗兔IgG，1∶200)，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min；再用PBS沖洗后加入鏈霉素抗生物素-過氧化物酶孵育10 min；PBS沖洗后用DAB顯色，常規(guī)脫水、透明和封片。

1.4.6Western印跡檢測 海馬組織放入EP管內(nèi)，將組織裂解，測定蛋白濃度，再將混勻的上樣緩沖液(5倍)加入，煮沸5 min，靜置室溫后離心，取上清液；制備分離膠后，進行加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，兔抗小鼠多克隆BDNF抗體 (1∶500)及CREB抗體(1∶800)孵育，在4℃搖床中放置24 h，TBST進行漂洗，二抗(鼠抗兔IgG，1∶5 000)常溫孵育2 h，用TBST漂洗，ECL發(fā)光，利用X光片進行曝光、顯影和定影。

1.5圖像分析 用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化及Western印跡結(jié)果進行圖像分析。計算平均光密度值(OD)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1鋅對 NPP 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，NPP組和Zn-NPP組逃避潛伏期明顯延長，原平臺所在象限游泳時間/總游泳時間比值和原平臺所在象限游泳路徑/總路徑比值明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NPP組比較，Zn-NPP組逃避潛伏期明顯縮短，原平臺所在象限游泳時間/總游泳時間比值和原平臺所在象限游泳路徑/總路徑比值明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組水迷宮實驗結(jié)果

與對照組比較：1)P<0.05；與NPP組比較：2)P<0.05，下表同

2.2免疫組化結(jié)果分析 BDNF陽性表達主要在細胞胞質(zhì)，部分胞核也被著色，而CREB陽性表達部位為細胞核，陽性部位被染成棕褐色，與對照組比較，NPP組和Zn-NPP組陽性表達量顯著增加(P<0.05)；與NPP組比較，Zn-NPP組陽性表達量均顯著降低(P<0.05)；見圖1，圖2，表2。

到目前為止，此類材料主要集中在金屬單質(zhì)類氧化石墨烯復(fù)合材料如納米銀-氧化石墨烯復(fù)合材料、納米金-氧化石墨烯復(fù)合材料，金屬氧化物類氧化石墨烯復(fù)合材料如MnO2-氧化石墨烯、ZnO-氧化石墨烯、TiO2-氧化石墨烯復(fù)合材料，陶瓷類氧化石墨烯復(fù)合材料如SiO2-氧化石墨烯復(fù)合材料的研究上。

2.3Western印跡結(jié)果分析 與對照組比較，NPP組、Zn-NPP組BDNF、CREB表達量顯著增加(P<0.05)；與NPP組比較，Zn-NPP組陽性表達量均顯著降低(P<0.05)；見圖3，表3。

圖1 各組海馬組織DG區(qū)BDNF陽性表達(DAB，×400)

圖2 各組海馬組織DG區(qū)CREB陽性表達(DAB，×400)

組別BDNFCREB對照組22.17±3.0616.38±2.51Zn-NPP組34.52±2.181)2)31.09±3.261)2)NPP組56.01±4.091)54.72±3.671)

圖3 各組海馬DG區(qū)的BDNF蛋白表達

組別BDNFCREBNPP組0.87±1.061)1.49±1.571)對照組0.29±1.290.84±1.18Zn-NPP組0.41±1.371)2)1.23±1.461)2)

3 討 論

鋅是體內(nèi)必需微量元素，參與基因表達、組織修復(fù)及記憶形成等生物學(xué)過程。海馬存在大量游離鋅離子，鋅離子在突觸間隙釋放后調(diào)控突觸后膜受體功能，同時突觸后神經(jīng)元也含有鋅離子，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能，近期研究表明，補鋅可使NPP小鼠學(xué)習(xí)記憶力得到改善，海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡率顯著下降〔7〕，其可能機制與海馬區(qū)P53蛋白表達改變密切相關(guān)，但是否與BDNF及CREB表達改變有關(guān)有待于進一步探索。

BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，如大腦皮層、海馬、紋狀體、杏仁核等部位都發(fā)現(xiàn)有BDNF存在。BDNF 在維持神經(jīng)元正常的生理功能(如神經(jīng)元增殖、分化等)、神經(jīng)的可塑性、突觸的連接及促進突觸生長等的作用顯著〔8，9〕。

當神經(jīng)系統(tǒng)受到傷害時，BDNF成為感受通路重要的神經(jīng)遞質(zhì)〔10〕。相關(guān)文獻結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元可塑性和功能損傷與BDNF表達變化密切相關(guān)〔11〕。其中，當海馬組織損傷后，會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶力顯著下降。研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，在海馬齒狀回(DG區(qū))定位后，將BDNF反義寡核苷酸用微量加樣器注入小鼠海馬DG區(qū)，其學(xué)習(xí)記憶力顯著下降，DG區(qū)BDNF mRNA表達也顯著降低，作用后興奮性突觸后電位也明顯降低，這些結(jié)果表明海馬DG區(qū)與BDNF 基因表達在學(xué)習(xí)記憶過程中作用顯著；相似研究發(fā)現(xiàn)，在慢性復(fù)合應(yīng)激可引起模型鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型鼠海馬內(nèi)BDNF蛋白表達降低，提示在損害學(xué)習(xí)記憶增強的慢性復(fù)合應(yīng)激大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能過程中BDNF起關(guān)鍵作用〔13〕。

BDNF在維持海馬功能和海馬依賴的記憶中發(fā)揮著重要作用，其機制可能為，在學(xué)習(xí)記憶損傷的過程中，BDNF前體被轉(zhuǎn)換成成熟的BDNF，從而增強BDNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，我們推測海馬損傷后通過BDNF信號通路來損傷學(xué)習(xí)記憶；而CREB在通路中的發(fā)揮重要作用，其為核轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵因子，在多種蛋白激酶(如：PKC、PKA等)的作用下可使其激活；使CREB發(fā)生自身磷酸化，此時具備雙聚體的CREB與cAMP 反應(yīng)元件(CRE)目標序列特異性結(jié)合，最終可調(diào)節(jié)多種基因轉(zhuǎn)錄功能。前輩發(fā)現(xiàn)，維持長時記憶的進程中，CREB起關(guān)鍵作用，其133位絲氨酸可被許多蛋白激酶激活，活化后這些蛋白激酶可轉(zhuǎn)移到細胞核，與 CREB結(jié)合并使其磷酸化，最終可促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄〔14〕。本研究提示，補鋅改善NPP小鼠認知功能的機制與調(diào)節(jié)海馬DG區(qū)神經(jīng)元BDNF表達有關(guān)。

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