野葛葉提取物體內(nèi)、外抗衰老活性

王翰華 楊曉春 倪夢茜

(浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100)

野葛是豆科葛屬多年生草質(zhì)藤本植物〔1〕，我國大部分地區(qū)均有分布。葛根是一味傳統(tǒng)的藥食同源中藥，具有保護心臟、降血壓、抗凋亡、降血糖、防治骨質(zhì)疏松、保護神經(jīng)、抗氧化和治療神經(jīng)病理性疼痛等多種活性〔2〕。葛花性味甘、辛、涼，入脾、胃經(jīng)，有和味解酒、生津止渴之功效。目前對葛根〔2〕和葛花〔3〕的研究已較為全面，但有關(guān)野葛葉的研究相對匱乏〔4〕。野葛葉提取物具有防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用〔5〕。本研究觀察野葛葉提取物體內(nèi)、外抗衰老活性。

1 材料和方法

1.1主要儀器 FS300Y-3型高速粉碎機(廣州雷邁機械設(shè)備有限公司)；DZKW-D-4電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；JD-500小鼠避暗儀(上海繼德教學(xué)實驗器械廠)；TGL-20高速冷凍離心機(四川蜀科儀器有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)和酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；TU-1818型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2材料與試劑 野葛葉購于安徽省亳州市藥材市場，經(jīng)浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥學(xué)院鑒定為豆科植物野葛的葉。D-半乳糖(D-gal)(江蘇鵬翔生物醫(yī)藥有限公司)；維生素(Vit)E(浙江醫(yī)藥股份有限公司，批號160339)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物研究所)；二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基、超氧陰離子自由基、2，2-聚氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基(美國Sigma公司)。試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.3野葛葉提取物的制備 取野葛葉粉末1 000 g，加4倍量60%乙醇，浸漬2 h，80℃水浴回流2.5 h，減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥，得野葛葉提取物粉末，于4℃下保存，臨用時加蒸餾水配制成所需濃度的溶液。

1.4實驗動物 昆明種小鼠，體質(zhì)量20～25 g，雌雄各半，由浙江大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(浙)2012-0178。

1.5體內(nèi)試驗

1.5.1動物分組、造模及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分成6組，每組10只，分別為：空白對照組、衰老模型組、VE對照組(50 mg/kg)和野葛葉提取物低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg/kg)劑量組。除空白對照組外，其他組參考文獻〔6，7〕的方法造模。將D-gal溶于生理鹽水，體積分數(shù)10%，頸背部皮下注射(劑量15 ml/kg)，連續(xù)6 w，空白對照組注射等體積生理鹽水。同時，VE對照組和野葛葉提取物各組按15 ml/kg，灌胃給藥，空白對照組和衰老模型組灌胃等體積生理鹽水。6 w后，小鼠摘眼球取血處死，分離血清，快速摘取肝臟和腦組織，進行新鮮組織勻漿，與預(yù)冷的生理鹽水混合，打勻4～5次后，1 000 r/min離心10 min，取上清液，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2一般行為學(xué)觀察 每日觀察小鼠的毛色、日常活動、進食和精神等情況；每周稱取小鼠體質(zhì)量。

1.5.3學(xué)習(xí)記憶能力測試(避暗實驗) 參考文獻〔8〕，在實驗開始的第5周進行避暗實驗。實驗前將小鼠頭背著洞口放入明室3 min，給暗室銅柵通電(36 V)，小鼠進入暗室即受電擊退回明室，如此訓(xùn)練5 min。24 h后實驗，記錄小鼠第1次進入暗室的時間(避暗潛伏期)及5 min內(nèi)小鼠進入暗室的次數(shù)(避暗錯誤次數(shù))。

1.5.4SOD活性、MDA含量和GSH-Px活性的測定 取小鼠血清及10%組織勻漿，照試劑盒說明書測定，重復(fù)3次，取平均值。

1.6體外實驗

1.6.1清除DPPH自由基測定 取4.0 ml不同質(zhì)量濃度的野葛葉提取液，參考文獻方法〔9〕配制待測液，于517 nm處測定吸光度A，平行3份。清除率(%)=〔1-(A-A0)/A1)〕×100%。其中A為野葛葉提取液與DPPH自由基混合溶液吸光度，A0為野葛葉提取液本身吸光度，A1為DPPH自由基溶液吸光度。

1.6.2清除超氧陰離子自由基測定 采用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法〔9〕。取 0.5 ml不同濃度的野葛葉提取液配制成待測液，于310 nm處測定A，平行3份。清除率(%)=〔1-(A1-A2)/A0〕×100%。其中A0為野葛葉提取液吸光度，A1為只加鄰苯三酚吸光度；A2為野葛葉提取液與鄰苯三酚混合溶液吸光度。

1.6.3清除ABTS自由基測定 參考文獻方法〔9〕，取不同濃度的野葛葉提取液2.0 ml，配制成待測液，于740 nm處測定A，平行3份。清除率(%)=〔1-(A-A0)/A1〕×100%。其中A為野葛葉提取液與ABTS自由基混合溶液吸光度，A0為野葛葉提取液吸光度，A1為ABTS自由基溶液吸光度。

1.6.4還原性測定 采用經(jīng)典普魯士法〔10〕。取2.0 ml不同濃度的野葛葉提取液，配制成供試液，于740 nm處測定吸光度A，A值與還原性呈正比。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1體內(nèi)試驗結(jié)果

2.1.1對一般行為學(xué)的影響 造模前各組毛發(fā)光亮，反應(yīng)靈敏，行動敏捷，飲食正常。隨著造模的進行，衰老模型組與空白對照組比較毛發(fā)暗淡，反應(yīng)遲鈍，嗜睡，進食減少，體質(zhì)量增長緩慢甚至減輕。同衰老模型組比較，VE對照組及野葛葉提取物各組上述癥狀都得到了不同程度的減輕。

2.1.2對學(xué)習(xí)記憶能力的影響 訓(xùn)練時，衰老模型組較空白對照組5 min內(nèi)錯誤數(shù)顯著增多(P<0.05)，野葛葉提取物低、中、高劑量組及VE對照組較衰老模型組5 min內(nèi)錯誤數(shù)顯著減少(P<0.05)。測試中，與空白對照組相比，衰老模型組5 min內(nèi)的錯誤數(shù)極顯著增多(P<0.01)，表明造模成功；野葛葉提取物各組及VE組較衰老模型組能明顯減少錯誤數(shù)(P<0.01)，且能極顯著增加避暗潛伏期(P<0.01)。提示野葛葉提取物能夠抵抗或恢復(fù)D-gal對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。見表1。

表1 各組記憶能力比較

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與衰老模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

2.1.3對血清、肝臟及腦組織中SOD、MDA和GSH-Px活性的影響 與空白對照組比較，衰老模型組血清、肝臟及腦組織中SOD活性及GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，MDA含量明顯增加(P<0.01)；與衰老模型組比較，VE對照組和野葛葉提取物各組血清、肝臟及腦組織中SOD和GSH-Px活性均有顯著提高，MDA含量顯著降低、差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。表明野葛葉提取物抗衰老的機制可能與增加SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量有關(guān)。

表2 各組血清、肝臟及腦組織中SOD、MDA 和GSH-Px活性比較

2.2體外試驗結(jié)果

2.2.1對DPPH自由基的清除 野葛葉提取物質(zhì)量濃度為25～400 μg/ml，對DPPH自由基清除率呈濃度依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度超過400 μg/ml時，清除率趨于平穩(wěn)。見圖1。

2.2.2對超氧陰離子自由基的清除 野葛葉提取物質(zhì)量濃度為25～300 μg/ml，對超氧陰離子自由基清除率呈濃度依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度超過300 μg/ml時，清除率趨于平穩(wěn)。見圖1。

2.2.3對ABTS自由基的清除 野葛葉提取物質(zhì)量濃度為25～400 μg/ml，對ABTS自由基的清除率呈濃度依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度超過400 μg/ml時，清除率趨于平穩(wěn)。見圖1。

2.2.4野葛葉提取物的還原力 野葛葉提取物質(zhì)量濃度為25～400 μg/ml，還原力隨濃度增加而顯著增強，達到400 μg/ml后，還原力逐漸平穩(wěn)。見圖1。

圖1 對DPPH、超氧陰離子、ABTS自由基和野葛葉提取物還原子的清除作用

3 討 論

衰老是機體各器官、組織功能隨年齡增長而發(fā)生退行性變化的過程〔11〕。D-gal致衰老模型中，D-gal在半乳糖氧化酶催化下，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，從而導(dǎo)致衰老反應(yīng)〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，過量的自由基是引起機體衰老的主要因素〔13，14〕。本研究通過體內(nèi)、外實驗表明，野葛葉提取物具有抗衰老作用，這可能與其直接或間接清除自由基，避免了因抗氧化性物質(zhì)消耗而導(dǎo)致機體衰老有關(guān)。本實驗使用60%乙醇作為提取溶劑，其提取物包含野葛葉絕大部分成分。接下來，可對其不同極性部位進行藥效學(xué)評價，篩選活性部位進行化學(xué)成分信息表征，并對其作用機制進行闡釋與驗證。對野葛葉的進步開發(fā)利用，可以擴大野葛的藥用部位，逐漸代替葛根藥用，利于藥源再生。

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