鹽酸小檗堿對(duì)人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞增殖及周期的影響

司 熙 孔晨飛 王曉峰

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，海南 ?？?570102)

腺樣囊性癌多發(fā)于涎腺，占涎腺腫瘤5%～10%，患者以中老年女性為主〔1〕。其發(fā)生使患者口腔干燥、疼痛，進(jìn)食困難。又因好發(fā)于頜面部而影響美觀，極大降低患者生活質(zhì)量。目前臨床治療以手術(shù)切除為主，輔以放療和化療，但復(fù)發(fā)率較高。因此需要尋找新的富有療效的化療藥物。小檗堿是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿，廣泛應(yīng)用于解熱鎮(zhèn)痛、抗菌及胃腸道疾病的治療。近年來，研究發(fā)現(xiàn)其還具有抗腫瘤的作用〔2～4〕。本文擬觀察鹽酸小檗堿對(duì)人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和對(duì)細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 鹽酸小檗堿(BBI生命科學(xué)公司)；CCK8(bimake公司)、細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(美國(guó)Gibco公司)、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)、凋亡試劑盒及周期試劑盒(南京凱基生物公司)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tektr公司)等。

1.2細(xì)胞株 人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院科研中心提供。采用含有10%胎牛血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞每3 d傳代一次，傳代時(shí)用濃度為0.25%的胰酶溶液進(jìn)行消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3CCK8法檢測(cè)鹽酸小檗堿對(duì)人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率 細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液并加入濃度為1、5、10、15、20 μg/ml的鹽酸小檗堿100 μl。另設(shè)對(duì)照孔，對(duì)照孔中加入培養(yǎng)液100 μl和稀釋藥物等量的二甲基亞砜(DMSO)。每組設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK8 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后于酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm的吸光度(OD值)，實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次。記錄結(jié)果計(jì)算各濃度鹽酸小檗堿對(duì)細(xì)胞的抑制率(IR)，計(jì)算公式：抑制率(%)=(對(duì)照孔OD值-加藥孔OD值)/對(duì)照孔OD值×100%。

1.4細(xì)胞周期檢測(cè) 細(xì)胞以5×105/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度鹽酸小檗堿的DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量的DMSO，培養(yǎng)24 h后消化細(xì)胞，4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮細(xì)胞，加入濃度為70%的乙醇溶液固定24 h后加入RNAase，在37℃水浴加熱30 min，加入碘化丙啶進(jìn)行熒光染色，后上機(jī)分析。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞以5×105/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶進(jìn)行消化并收集細(xì)胞。同樣用4℃ PBS洗滌后進(jìn)行離心收集，用100 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并加入5 μl Annexin V-FITC，37℃避光孵育15 min。再向細(xì)胞混懸液中加入5 μl碘化丙啶(PI)作用5 min后上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，IC50 計(jì)算采用線性回歸。

2 結(jié) 果

2.1鹽酸小檗堿對(duì)人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的鹽酸小檗堿對(duì)人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞有著不同程度的體外抑制作用，同時(shí)也表現(xiàn)為一定程度的劑量依賴性(P<0.05)。鹽酸小檗堿的藥物濃度分別為1、5、10、15、20 μg/ml的細(xì)胞存活率分別為(97.14±1.25)%、(80.72±0.86)%、(59.37±1.51)%、(37.08±1.74)%、(13.86±0.85)%，較對(duì)照組(100.00%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。鹽酸小檗堿的濃度與抑制率之間的線性回歸分析為，R2=0.991 8，Y=-0.018 6x2-3.992 2x+101.15，根據(jù)公式最后所得IC50=12.13 μg/ml，IC30=7.50 μg/ml、IC15=4.00 μg/ml。

2.2鹽酸小檗堿對(duì)人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞周期的影響 作用24 h后，3組與對(duì)照組相比表現(xiàn)為G1期減少，S、G2期增加(P<0.05)，見表1。

表1 鹽酸小檗堿對(duì)人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3鹽酸小檗堿對(duì)人腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用 作用24 h，細(xì)胞凋亡率分別為(7.5±0.7)%、(14.2±1.5)%、(23.1±1.8)%，與對(duì)照組(3.1±1.6)%相比顯著增加(P<0.05,P<0.01)。

3 討 論

涎腺腺樣囊性癌目前臨床治療以手術(shù)切除為主，對(duì)于中晚期和復(fù)發(fā)性腫瘤常加以化療。目前已有多項(xiàng)研究評(píng)估了多種化療藥對(duì)涎腺腺樣囊性癌的療效，但至今仍未找到特效化療藥。例如，5-氟尿嘧啶是一種應(yīng)用較久的化療藥，用于治療乳腺癌及胃腸道腫瘤〔5〕。Tannock等〔6〕嘗試將其應(yīng)用于涎腺腺樣囊性癌，但結(jié)果并不理想，有效率僅為33%。順鉑是一種重要的一線化療藥，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、肝癌、睪丸癌、卵巢癌、膀胱癌和頭頸部腫瘤等各種惡性腫瘤的治療〔7〕。Licitra等〔8〕應(yīng)用順鉑治療中晚期及復(fù)發(fā)性涎腺腺樣囊性癌發(fā)現(xiàn)有效率僅為15%。而在De Haan等〔9〕觀察的10例應(yīng)用順鉑治療的患者中，竟無一有效。其他常用化療藥如吉西他濱、米托蔥醌、多柔比星等對(duì)涎腺腺樣囊性癌均無明顯的療效。

小檗堿的抗腫瘤活性在多種腫瘤的研究中得到了證實(shí)，部分研究已經(jīng)涉及機(jī)制。Singh等〔2〕發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠降低惡性黑色素瘤細(xì)胞中前列腺素E2、前列腺素E2受體和環(huán)氧合酶2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞遷移。在前列腺癌PC-3細(xì)胞系中，小檗堿能夠通過誘導(dǎo)活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔3〕。另外，在乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中，小檗堿還能夠通過抑制AMPK-HIF通路逆轉(zhuǎn)缺氧所導(dǎo)致的耐藥〔4〕。

細(xì)胞凋亡是一種重要的生命現(xiàn)象，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均有密切關(guān)系。細(xì)胞凋亡的發(fā)生涉及線粒體途徑、死亡受體介導(dǎo)的外部凋亡途徑、B粒酶途徑等多種途徑〔10〕。本研究證實(shí)了鹽酸小檗堿對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞具有良好的抑制作用。本文結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠引起細(xì)胞周期停滯于S期，并且能夠誘導(dǎo)ACC2細(xì)胞發(fā)生凋亡，且二者均呈現(xiàn)出劑量依賴性。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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10李 敏，林 俊.細(xì)胞凋亡途徑及其機(jī)制〔J〕.國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2014；41(2)：102-7.