黃連乙醇提取物對生理及鏈脲佐菌素致病理狀態(tài)下小鼠抑郁和焦慮行為的影響

常曉茜 李亞萍 王君明 蔡 泓 陳榮幸 趙恒利 崔 瑛

(河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

黃連為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(C.teetaWall.)的干燥根莖，藥性苦寒，歸心經(jīng)，具有清心解郁除煩之功。黃連及其復(fù)方如左金丸、黃連阿膠湯等對抑郁癥或焦慮癥具有治療作用，且已取得了一些初步的研究進展〔1，2〕。此外，黃連尚有降糖作用〔3〕。鏈脲佐菌素(STZ)是復(fù)制糖尿病常用的工具藥，而且，現(xiàn)代研究表明，STZ除了誘發(fā)糖尿病之外，尚可引起抑郁和焦慮〔4〕。本研究旨在觀察黃連55%乙醇提取物(CCEE)對生理狀態(tài)及STZ致病理狀態(tài)下小鼠抑郁和焦慮行為的影響。

1 材料與方法

1.1動物、主要藥物與儀器 昆明(KM)小鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，由河南省實驗動物中心提供〔SCXK(豫) 2015-0004〕。黃連：鄭州瑞龍制藥股份有限公司，產(chǎn)地四川，批號140702，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)科陳隨清教授鑒定確認為毛茛科植物黃連(C.chinensisFranch.)的干燥根莖。鹽酸二甲雙胍片：北京京豐制藥集團，批號150715；鹽酸氟西汀：常州四藥制藥有限公司，批號201410103；STZ：Sigma，貨號S0130；枸櫞酸(分析純)：天津致遠化學(xué)試劑有限公司，批號20150201。大小鼠開場活動實驗系統(tǒng)：成都泰盟軟件有限公司，OFT-100；高架十字迷宮視頻分析系統(tǒng)(XR-XG201)，高通量強迫游泳實驗系統(tǒng)(XR-XQ202)，高通量懸尾實驗系統(tǒng)(XR-XX203)；明暗箱實驗系統(tǒng)(XR-XB120)：上海欣欣信息科技有限公司；高速中藥粉碎機：浙江省永康市溪岸五金藥具廠，HX-200。

1.2CCEE制備 采用黃連根莖粗粉，每1 g黃連粗粉加10 ml體積分?jǐn)?shù)為55%的乙醇(W/V=1∶10)，回流提取2次，每次2 h，4 000 r/min離心10 min，合并離心上清液，回收乙醇至浸膏，55℃減壓干燥，稱重，4℃保存待用。經(jīng)計算，黃連醇提物得率為26.44%。

1.3動物實驗處理 用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.2)配制STZ注射液，小鼠在禁食16 h后(不禁水)一次性腹腔注射(ip) STZ(150 mg/kg)造糖尿病模型；造模后的小鼠經(jīng)過72 h自由飲食后，于尾靜脈取血用血糖儀測定血糖值(血糖>11.1 mmol/L為糖尿病模型制作成功)，篩選血糖>11.1 mmol/L的小鼠進入STZ病理狀態(tài)下實驗觀測。另取30只小鼠，用于生理狀態(tài)下(非STZ處理)實驗觀測。CCEE給予生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠的劑量均為低劑量(50 mg/kg)和高劑量(200 mg/kg),陽性藥組采用鹽酸二甲雙胍(MH，100 mg/kg)和鹽酸氟西汀(FH，10 mg/kg)聯(lián)合用藥〔灌胃(ig)給藥〕，STZ組和溶媒對照組只ig給予等量溶媒(0.5%CMC-Na)，各組連續(xù)給藥21 d，末次給藥后1 h進行行為學(xué)測試。

1.4開場實驗(OFT)、高架十字迷宮實驗(EPM)和明暗箱實驗(LDT) OFT：采用OFT系統(tǒng)，將小鼠放于敞箱的中央，觀測小鼠在5 min內(nèi)的運動時間和站立次數(shù)。EPM：將小鼠置于裝置的迷宮中央，頭朝開臂，記錄5 min內(nèi)小鼠進入開臂次數(shù)(OE)、進入開臂時間(OT)、進入封閉臂次數(shù)(CE)、進入封閉臂時間(CT)，計算小鼠在300 s內(nèi)的開臂進入次數(shù)百分比(OE%)和在開臂滯留時間百分比(OT%)。LDT：將小鼠置于LDT裝置的明箱一側(cè)，拉出擋板，立即開始記錄實驗數(shù)據(jù)，觀察記錄小鼠在5 min內(nèi)的穿箱次數(shù)。

1.5懸尾實驗(TST)和強迫游泳實驗(FST) TST：采用TST系統(tǒng)，距小鼠尾部2 cm處用醫(yī)用膠帶把小鼠尾巴與掛鉤粘貼固定，頭部向下懸掛，實驗時間設(shè)置為360 s，記錄小鼠在120～360 s內(nèi)的懸尾不動時間。FST：采用FST系統(tǒng)，將小鼠放于水位為25 cm、水溫為25℃的透明的柱狀圓桶中，實驗時間設(shè)置為360 s，記錄小鼠在120～360 s內(nèi)的游泳不動時間。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、LSD法及DunnettT3法。

2 結(jié) 果

2.1CCEE對生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠OFT運動時間和站立次數(shù)的影響 與生理狀態(tài)下的溶媒對照組比較，CCEE高劑量顯著升高了生理狀態(tài)下小鼠在OFT中的運動時間(P<0.01)，而STZ處理后顯著降低了小鼠在OFT中的運動時間和站立次數(shù)(均P<0.01)；與STZ組比較，陽性藥組和CCEE高劑量組均可顯著升高STZ小鼠在OFT中的運動時間和站立次數(shù)(均P<0.01)，而CCEE低劑量只可顯著升高運動時間(P<0.01)，對站立次數(shù)無明顯影響(P>0.05)。見表1。

表1 CCEE對生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠抑郁和焦慮行為的影響

與溶媒對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與STZ組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.2CCEE對生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下TST和FST不動時間的影響 與溶媒對照組比較，CCEE高劑量顯著降低了生理狀態(tài)下小鼠在TST和FST中的不動時間(均P<0.05)，而STZ處理后則顯著升高了小鼠在TST和FST中的不動時間(均P<0.01)；與STZ組比較，陽性藥組和CCEE高劑量均可顯著降低STZ小鼠在TST和FST中的不動時間(均P<0.01)，而CCEE低劑量只可顯著降低在TST中的不動時間(P<0.01)，而對在FST中的不動時間則無明顯影響(P>0.05)。見表1。

2.3CCEE黃連醇提物對生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠在EPM的OE%和OT%的影響 與溶媒對照組比較，CCEE高劑量顯著升高了生理狀態(tài)下小鼠在EPM中的OE%(P<0.05)，而STZ處理后則顯著降低了小鼠在EPM中的OE%和OT%(分別P<0.01，P<0.05)；與STZ組比較，陽性藥組和CCEE高劑量均可顯著升高STZ小鼠在EPM中的OE%和OT%(P<0.05或P<0.01)，而CCEE低劑量對此則均無明顯影響(均P>0.05)。見表1。

2.4CCEE對生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠LDT穿箱次數(shù)的影響 與溶媒對照組比較，STZ處理后顯著降低了小鼠在LDT的穿箱次數(shù)(P<0.01)，而CCEE的低劑量和高劑量在小鼠生理狀態(tài)下對此均無明顯影響；與STZ組比較，陽性藥組、CCEE低劑量及高劑量均可顯著升高STZ小鼠在LDT中的穿箱次數(shù)(分別P<0.01，P<0.05，P<0.01)。見表1。

3 討 論

糖尿病患者飲食受限、生活質(zhì)量下降更易引發(fā)抑郁、焦慮等負面情緒，終而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)抑郁癥或(和)焦慮癥。再者，抑郁癥或(和)焦慮癥患者缺乏運動且飲食不規(guī)律，服藥依從性差，更加不利于糖尿病的治療，二者之間的相互影響也加大了糖尿病抑郁癥或(和)焦慮癥的治療難度。中醫(yī)藥具有注重整體調(diào)節(jié)、藥物天然易得、多靶點效應(yīng)等特點和優(yōu)勢，能夠有效地降低血糖和預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。從中藥中開發(fā)針對糖尿病及其并發(fā)癥的安全高效藥物，已成為研究熱點之一〔5〕。

TST和FST是抑郁癥及抗抑郁藥篩選常用的實驗測試工具，動物在這兩種測試中的不動時間如果明顯升高，常表示動物處于行為絕望的抑郁狀態(tài)，反之則表示藥物可能具有抗抑郁作用〔6〕。本研究提示CCEE高劑量對生理狀態(tài)下小鼠具有抗抑郁作用。STZ可誘導(dǎo)小鼠的抑郁行為，這與文獻報道的結(jié)果一致〔7〕。CCEE高劑量對生理狀態(tài)下和STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的抑郁行為均有明顯改善作用，而CCEE低劑量只對STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的抑郁行為具有明顯改善作用，而對生理狀態(tài)下小鼠的抑郁行為無明顯影響，一定程度上提示CCEE對STZ糖尿病病理狀態(tài)下的抗抑郁作用較對其生理狀態(tài)下的作用更為敏感。推測這可能與CCEE既可針對STZ病理狀態(tài)下的高血糖進行干預(yù)，又可針對STZ病理狀態(tài)下的抑郁行為進行治療，即與這樣的一種雙重作用有關(guān)。

EPM和LDT是焦慮癥及抗焦慮藥篩選常用的實驗測試工具。動物在EPM測試中的OE%或(和)OT%如果明顯降低，常表示動物處于焦慮狀態(tài)，反之表示藥物可能具有抗焦慮作用〔8〕；同樣，在LDT測試中的穿箱次數(shù)如果明顯降低，則常表示動物處于焦慮狀態(tài)，反之則表示藥物可能具有抗焦慮作用〔7〕。在本研究中，之前CCEE高劑量僅從OE%的分析層面呈現(xiàn)出了明顯的抗焦慮作用，而CCEE低劑量在EPM和LDT測試中均未呈現(xiàn)出抗焦慮作用。STZ處理誘導(dǎo)了小鼠的焦慮行為，這與之前報道的結(jié)果一致〔9〕。CCEE高劑量對小鼠在STZ糖尿病病理狀態(tài)下的焦慮行為均具有明顯改善作用；CCEE低劑量只可使該病理狀態(tài)下小鼠在LDT的穿箱次數(shù)顯著升高，提示至少從LDT測試的角度來說，CCEE低劑量對STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的焦慮行為具有明顯改善作用。進一步總結(jié)分析可知，CCEE高劑量對生理狀態(tài)下和STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的焦慮行為均有明顯改善作用，而CCEE低劑量只對STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的焦慮行為具有明顯改善作用，而對生理狀態(tài)下小鼠的焦慮行為無明顯影響，一定程度上提示CCEE對STZ糖尿病病理狀態(tài)下的抗焦慮作用較對其生理狀態(tài)下的作用更為敏感。推測這可能與CCEE既可針對STZ病理狀態(tài)下的高血糖進行干預(yù)，又可針對STZ病理狀態(tài)下的抑郁行為進行治療，即與這樣的一種雙重作用有關(guān)。

此外，本研究中，MH和FH聯(lián)合用藥對STZ病理狀態(tài)下的抑郁和焦慮行為均起到了較好的治療作用，實際上這不僅與MH的降糖作用及FH的抗抑郁作用有關(guān)，還可能與FH的抗焦慮〔10〕、MH的抗焦慮〔11〕和抗抑郁〔12〕的綜合作用有關(guān)。

綜上所述，本研究證實了CCEE高劑量對生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠抑郁和焦慮行為均有改善作用，而CCEE低劑量僅對STZ病理狀態(tài)下小鼠的抑郁和焦慮行為具有改善作用。一定程度上，CCEE對STZ 糖尿病病理狀態(tài)下的治療作用較對其在生理狀態(tài)下的治療作用更為敏感。

4 參考文獻

1張月月,王君明,崔 瑛,等.中藥生物堿類成分抗焦慮或抑郁活性及黃連生物堿藥理作用研究進展〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2015;20(4):1184-7.

2耿慧春.黃連阿膠湯抗焦慮作用的最佳配比和提取工藝的實驗研究〔D〕.哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),2005.

3馬 航,胡慭然,鄒宗堯,等.黃連生物堿降糖作用研究及構(gòu)效關(guān)系初探〔J〕.中國藥理學(xué)通報,2015;31(11):1575-9.

4Lenart L,Hodrea J,Hosszu A,etal.The role of sigma-1 receptor and brain-derived neurotrophic factor in the development of diabetes and comorbid depression in streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Psychopharmacology(Berl),2016;233(7):1269-78.

5Liu W,Zheng Y,Zhang Z,etal.Hypoglycemic,hypolipidemic and antioxidant effects of Sarcandra glabra polysaccharide in type 2 diabetic mice〔J〕.Food Funct,2014;5(11):2850-60.

6Umukoro S,Adebesin A,Agu G,etal.Antidepressant-like activity of methyl jasmonate involves modulation of monoaminergic pathways in mice〔J〕.Adv Med Sci,2017;63(1):36-42.

7Castillo-Gómez E,Coviello S,Perez-Rando M,etal.Streptozotocin diabetic mice display depressive-like behavior and alterations in the structure,neurotransmission and plasticity of medial prefrontal cortex interneurons〔J〕.Brain Res Bull,2015;116:45-56.

8Cui Y,Rong C,Wang J,etal.Mechanism-based anti-anxiety effects of polysaccharides extracted from shudihuang(radix rehmanniae preparata) by two-dimensional electrophoresis analysis in rat hippocampus proteins〔J〕.J Tradit Chin Med,2013;33(4):524-30.

9Gupta D,Radhakrishnan M,Kurhe Y.Insulin reverses anxiety-like behavior evoked by streptozotocin-induced diabetes in mice〔J〕.Metab Brain Dis,2014;29(3):737-46.

10Ansai S,Hosokawa H,Maegawa S,etal.Chronic fluoxetine treatment induces anxiolytic responses and altered social behaviors in medaka,Oryzias latipes〔J〕.Behav Brain Res,2016;303(1):126-36.

11Sarkaki A,Farbood Y,Badavi M,etal.Metformin improves anxiety-like behaviors through AMPK-dependent regulation of autophagy following transient forebrain ischemia〔J〕.Metab Brain Dis,2015;30(5):1139-50.

12Guo M,Mi J,Jiang QM,etal.Metformin may produce antidepressant effects through improvement of cognitive function among depressed patients with diabetes mellitus〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol,2014;41(9):650-6.