農(nóng)田土壤硝化反硝化作用及其對(duì)生物炭添加響應(yīng)的研究進(jìn)展*

趙光昕，張晴雯，劉杏認(rèn)**，田秀平

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農(nóng)田土壤硝化反硝化作用及其對(duì)生物炭添加響應(yīng)的研究進(jìn)展*

趙光昕1, 2，張晴雯2，劉杏認(rèn)2**，田秀平1**

（1. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

氧化亞氮（N2O）是重要的溫室氣體之一，還會(huì)破壞大氣臭氧層，影響全球氣候變化。農(nóng)田土壤是N2O最主要的排放源，由微生物主導(dǎo)的硝化和反硝化作用是其最主要的排放途徑，因此，土壤的硝化和反硝化作用備受關(guān)注。在綜合國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，就區(qū)分硝化和反硝化作用對(duì)N2O排放貢獻(xiàn)的研究方法、土壤N2O產(chǎn)生途徑及其影響因素以及施用生物炭對(duì)N2O排放的影響機(jī)理進(jìn)行歸納總結(jié)。結(jié)果表明：硝化和反硝化作用對(duì)生物炭的響應(yīng)不同，在N2O減排效應(yīng)上也存在很大的不確定性，其內(nèi)在機(jī)理尚不明確。在此基礎(chǔ)上，提出區(qū)分硝化和反硝化作用對(duì)N2O排放貢獻(xiàn)的最佳研究方法，并就農(nóng)田土壤硝化反硝化作用的影響因素以及對(duì)生物炭的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究展望。

氧化亞氮；硝化抑制劑；土壤微生物；功能基因

氧化亞氮（N2O）是重要的溫室氣體之一，其增溫潛勢(shì)是二氧化碳（CO2）的310倍左右，工業(yè)化以來(lái)大氣中N2O的濃度從270 mg·kg?1增至324 mg·kg?1[1]。與CO2和甲烷（CH4）不同的是，N2O氣體不僅引起溫室效應(yīng)，還對(duì)位于平流層的臭氧層造成不可恢復(fù)的破壞，對(duì)人類的生活健康造成威脅。因此，N2O在大氣中的濃度變化及其對(duì)全球氣候變化的影響備受關(guān)注[2]。據(jù)估計(jì)，大氣中至少70%的N2O來(lái)自農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)。其中，農(nóng)田土壤的硝化反硝化作用是產(chǎn)生N2O的主要途徑，是N2O排放的主要來(lái)源[3]。中國(guó)是世界上氮肥施用最多的國(guó)家之一，隨著氮肥施用量逐年增加，N2O的排放量也逐漸增加。因此，探明硝化反硝化作用對(duì)農(nóng)田土壤N2O排放的相對(duì)貢獻(xiàn)，并針對(duì)性地采取減排措施是農(nóng)業(yè)應(yīng)對(duì)全球氣候變化的迫切需求。

多數(shù)情況下，硝化過(guò)程和反硝化過(guò)程在土壤中是同時(shí)發(fā)生的，相關(guān)微生物的硝化作用和反硝化作用會(huì)同時(shí)產(chǎn)生N2O。由于土壤條件的異質(zhì)性和微生物活性狀況的復(fù)雜性，多數(shù)情況難以準(zhǔn)確區(qū)分硝化與反硝化過(guò)程。近年來(lái)，區(qū)分硝化反硝化作用產(chǎn)生N2O途徑的研究方法主要有抑制劑添加法、同位素標(biāo)記法和氣壓過(guò)程分離方法（BaPS）等。

生物炭是通過(guò)在缺氧條件下將生物質(zhì)包括農(nóng)業(yè)廢物、動(dòng)物糞便和工業(yè)木材副產(chǎn)物等進(jìn)行熱解轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的具有相對(duì)較高碳含量、理化性質(zhì)穩(wěn)定、孔隙度和比表面積大的固體物質(zhì)，生物炭表面含有豐富的含氧官能團(tuán)可以與H+結(jié)合，能夠減輕土壤酸化，提高氮肥利用率；農(nóng)業(yè)循環(huán)中利用其較高的含碳量，可以達(dá)到土壤碳封存的目的[4-6]。近年來(lái)，生物炭用于溫室氣體減排的研究逐漸增加[7-9]，多數(shù)研究表明，施用生物炭能夠改善土壤的理化性質(zhì)，影響土壤的硝化反硝化過(guò)程，間接影響土壤N2O排放[10-14]，為生物炭的合理利用提供了大量依據(jù)。區(qū)分并準(zhǔn)確測(cè)定硝化作用和反硝化作用對(duì)N2O排放的貢獻(xiàn)，有助于深入理解生物炭對(duì)土壤N2O排放的影響機(jī)理，目前相關(guān)研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。為此，本研究綜述就區(qū)分土壤N2O排放貢獻(xiàn)的方法，N2O產(chǎn)生的關(guān)鍵微生物過(guò)程和生物炭對(duì)N2O排放的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)農(nóng)田土壤硝化反硝化作用以及生物炭的研究重點(diǎn)和方向進(jìn)行展望，以期為減緩氣候變化及生物炭的廣泛應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 區(qū)分硝化與反硝化對(duì)N2O排放貢獻(xiàn)的方法

1.1 抑制劑添加法

抑制劑添加法是通過(guò)添加一些外源物質(zhì)或底物來(lái)選擇性地對(duì)硝化作用或者反硝化作用進(jìn)行抑制，阻止其產(chǎn)生N2O。此方法是通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間段內(nèi)不同抑制處理的N2O排放通量，采用差減法計(jì)算未被抑制過(guò)程的N2O排放貢獻(xiàn)，從而算出土壤對(duì)產(chǎn)生N2O的貢獻(xiàn)率。在硝化的兩步反應(yīng)中，氨氧化菌和亞硝化菌其中任何一步反應(yīng)被抑制，整個(gè)硝化反應(yīng)就會(huì)被抑制。硝化抑制劑通過(guò)抑制硝化過(guò)程的酶活性來(lái)抑制土壤中NH4+向NO3?的轉(zhuǎn)化。最常見(jiàn)的硝化抑制劑主要有雙氰銨（DCD）、乙炔（C2H2）、2?氯?6三氯甲基吡啶（CP）等[15]。其中實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛的抑制劑C2H2能夠被氨單加氧酶催化生成一種活性很強(qiáng)的不飽和環(huán)氧化物，該環(huán)氧化物可以與氨單加氧酶的活性位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，抑制酶對(duì)NH4+的催化[16]。反硝化過(guò)程主要由厭氧微生物主導(dǎo)，即實(shí)驗(yàn)室常用純氧或者C2H2和純氧結(jié)合來(lái)抑制反硝化作用[17-18]。

C2H2抑制技術(shù)可用于小面積和大面積的反硝化常規(guī)測(cè)定以及研究氮循環(huán)過(guò)程，研究表明低濃度C2H2（0.01%～0.1%）能夠抑制自養(yǎng)氨氧化過(guò)程，即抑制硝化作用N2O的產(chǎn)生與排放，C2H2含量為0.1%～1.0%時(shí)，可以抑制反硝化過(guò)程N(yùn)2O還原成N2。C2H2抑制法的缺點(diǎn)在于操作復(fù)雜不易控制，首先C2H2的擴(kuò)散會(huì)受到土壤含水量及其它結(jié)構(gòu)因素的影響，導(dǎo)致濃度分布不均勻，其次由于抑制了NO3?的生成，硝化作用和反硝化作用可能被C2H2同時(shí)抑制。所以，C2H2抑制技術(shù)適合在小的空間尺度上對(duì)硝化反硝化作用進(jìn)行區(qū)分[19]，然而進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)不可避免地將土壤樣本采集到實(shí)驗(yàn)室，這會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的偏差[20]。雖然C2H2是目前效果最好的抑制劑，但是C2H2抑制法仍然存在一些問(wèn)題，如土壤中某些微生物能利用C2H2作為碳源，從而消耗C2H2；C2H2會(huì)影響微生物的呼吸作用，以及在土壤中的擴(kuò)散是否均勻等。

1.2 同位素標(biāo)記法

氮（N）元素在自然界中存在兩種天然同位素，分別為14N和15N，其中14N占比99.63%。N同位素示蹤法主要利用15N對(duì)NO3?庫(kù)或NH4+庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)對(duì)底物NO3?庫(kù)和NH4+庫(kù)的變化量以及硝化反硝化作用產(chǎn)生氣體的量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算硝化反硝化過(guò)程對(duì)N2O生成的貢獻(xiàn)[21]。然而添加15N標(biāo)記的NH4+或NO3?改變了土壤硝化作用或反硝化作用的基質(zhì)供應(yīng)水平，從而可能影響硝化和反硝化過(guò)程，因而可能無(wú)法真實(shí)反映田間條件下的真實(shí)狀況。同位素標(biāo)記法通常與C2H2抑制結(jié)合使用，C2H2作為氣體比其它抑制劑更容易迅速進(jìn)入土壤阻止硝化作用[22]。雖然抑制劑法和15N示蹤技術(shù)單獨(dú)使用或結(jié)合使用均可很好地分析土壤中硝化反硝化對(duì)N2O排放產(chǎn)生的貢獻(xiàn)，但是均無(wú)法確定哪些菌對(duì)N2O的貢獻(xiàn)最為顯著，還應(yīng)結(jié)合分子生態(tài)學(xué)的方法對(duì)復(fù)雜的硝化反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。將穩(wěn)定同位素和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，不僅可以對(duì)N2O的排放量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，而且還可以確定自養(yǎng)硝化、異養(yǎng)硝化以及反硝化作用對(duì)N2O排放的相對(duì)貢獻(xiàn)[23]。由于抑制劑的加入，常常會(huì)不同程度地影響其它反應(yīng)生成N2O，導(dǎo)致各步驟產(chǎn)生N2O的量被低估，雙同位素（15N和18O）自然豐度法和同位素位嗜值（site preferences）為區(qū)分硝化和反硝化對(duì)N2O排放的貢獻(xiàn)提供了新的思路[24]。通過(guò)15N和18O雙重標(biāo)記，可以觀測(cè)N2O形成過(guò)程中的N庫(kù)和O庫(kù)的變化，并分析出硝化反硝化過(guò)程產(chǎn)生的N2O中N和O原子的來(lái)源，從而區(qū)分硝化反硝化作用對(duì)N2O排放的貢獻(xiàn)。然而雙同位素標(biāo)記法由于設(shè)備昂貴和操作要求，阻礙了其在區(qū)分硝化反硝化過(guò)程中的準(zhǔn)確性和適用性，并且18O同位素相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少，不利于分析。同位素位嗜值又稱位點(diǎn)偏好，不同微生物過(guò)程和官能團(tuán)具有不同的位點(diǎn)偏好，且合成14N2O和15N2O所需的能量不同，根據(jù)以上原理將同位素的相對(duì)比例轉(zhuǎn)化為同位素異構(gòu)體的比例，并利用同位素位嗜值作為參數(shù)來(lái)量化硝化反硝化作用對(duì)N2O形成的貢獻(xiàn)[25]。

1.3 氣壓過(guò)程分離法

氣壓過(guò)程分離法（Barometric process separation, BaPS）主要用于測(cè)定微生物的生理活動(dòng)對(duì)土壤碳氮轉(zhuǎn)化速率的影響，是一種區(qū)分土壤硝化反硝化作用貢獻(xiàn)的新方法。BaPS系統(tǒng)是基于土壤樣品的CO2、O2和總氣體平衡的測(cè)定，通過(guò)測(cè)定系統(tǒng)中壓力的變化來(lái)計(jì)算N2O等氣體的產(chǎn)生量。BaPS測(cè)量方法采用儀器配套的環(huán)刀進(jìn)行采樣和測(cè)量，與乙炔抑制法和同位素示蹤法相比，減小了人工處理對(duì)土壤的干擾，可以真實(shí)反應(yīng)土壤微生物的活動(dòng)情況。據(jù)研究，BaPS法在測(cè)量通氣良好的土壤時(shí)與同位素示蹤法同樣準(zhǔn)確[26]。該方法不需要添加任何物質(zhì)，便可以較好地反映土壤真實(shí)的硝化、反硝化和呼吸作用。但該方法建立在一系列假設(shè)之上，這些假設(shè)并不在任何條件下都成立，而且其對(duì)系統(tǒng)做了過(guò)多的簡(jiǎn)化，因此，應(yīng)用氣壓過(guò)程分離方法區(qū)分硝化作用和反硝化作用對(duì)N2O排放貢獻(xiàn)率的研究報(bào)道并不多。

2 土壤N2O產(chǎn)生途徑及其影響因素

2.1 硝化作用及關(guān)鍵微生物

硝化作用一般由氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌共同完成，主要分兩個(gè)階段：第一個(gè)階段是在氨氧化細(xì)菌（ammonia-oxidizing bacteria, AOB）和氨氧化古菌（ammonia-oxidizingarchaea, AOA）的A基因產(chǎn)生的氨單加氧酶作用下，將氨（NH3）氧化成羥胺（NH2OH），之后在羥胺氧化還原酶的作用下進(jìn)一步氧化成NO2?的過(guò)程，其中氨單加氧酶是硝化反應(yīng)的限速步驟。第二個(gè)階段是由亞硝酸鹽氧化菌的基因主導(dǎo)的亞硝酸鹽氧化還原酶催化下發(fā)生的亞硝化反應(yīng)，將NO2?進(jìn)一步氧化成NO3?。其過(guò)程如圖1所示。

①氨單加氧酶Ammonia monooxygenase （AMO）②羥氨氧化還原酶Hydroxylamine oxidoreductase（HAO）③亞硝酸鹽氧化還原酶Nitrite oxidoreductase（NOR）④硝酸鹽還原酶Nitrate reductase（Nar）⑤亞硝酸鹽還原酶（e?1）Nitrite reductase（Nir）⑥一氧化氮還原酶Nitric oxide reductase（Nor）⑦氧化亞氮還原酶Nitrous oxide reductase（Nos）⑧亞硝酸鹽還原酶（6e?）Nitrite reductase（Nir）

在硝化過(guò)程中，中間產(chǎn)物NH2OH或NO2?會(huì)發(fā)生化學(xué)分解或不完全氧化釋放出N2O[28-29]。有研究發(fā)現(xiàn)，亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）的細(xì)胞色素（cyt，p460）酶可在缺乏氧氣條件下將NH2OH定量轉(zhuǎn)化為N2O[30]。還有研究發(fā)現(xiàn)，硝化螺菌屬的某種“完全硝化菌”可將NH3直接氧化為NO3?，該菌種具有編碼氨氧化和亞硝酸鹽氧化兩個(gè)過(guò)程的功能基因[31]。氨氧化過(guò)程被認(rèn)為是硝化作用的限速步驟，在AOA發(fā)現(xiàn)前，氨氧化過(guò)程一直被認(rèn)為主要由AOB進(jìn)行。對(duì)土壤中氨氧化菌的研究通常利用和A兩個(gè)基因，這兩個(gè)基因的相對(duì)豐度代表了AOB在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)中的分布水平。對(duì)AOB的基因序列的研究表明，AOB主要分為變形桿菌綱β亞群和γ亞群的亞硝化球菌屬[32]。土壤生態(tài)系統(tǒng)的AOB主要源于β亞綱中的亞硝化單胞菌（）和亞硝化螺菌（）兩個(gè)屬，包含了9個(gè)不同的種群，廣泛分布于陸地生態(tài)系統(tǒng)中。而目前發(fā)現(xiàn)的氨氧化古菌主要為泉古菌類（），由于AOA存在太多未知菌種，分離培養(yǎng)困難，關(guān)于AOA的認(rèn)知還處于起步階段。有研究發(fā)現(xiàn)，AOA在中國(guó)酸性紅壤中是優(yōu)勢(shì)菌群，其豐度與土壤硝化速率呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)關(guān)系[33]。另有研究表明，堿性潮土中AOA豐度雖然大于AOB，但是只有AOB豐度與硝化速率顯著相關(guān)并隨施肥處理發(fā)生改變[34]。上述研究表明，土壤中AOB和AOA可能在不同的土壤環(huán)境中起主導(dǎo)作用，AOA更容易適應(yīng)酸性且養(yǎng)分低的土壤，并在硝化過(guò)程中起主導(dǎo)作用，而AOB更適合在中堿性土壤中生存并進(jìn)行硝化作用。對(duì)AOA和AOB的研究表明，在大部分土壤中AOA的相對(duì)豐度比AOB高，但在營(yíng)養(yǎng)豐富的特殊環(huán)境中，AOB的相對(duì)豐度要高于AOA[35-36]，二者氨氧化過(guò)程的區(qū)別有待深入研究。

硝化作用分為自養(yǎng)硝化作用和異養(yǎng)硝化作用兩種類型，其中自養(yǎng)硝化微生物可以利用CO2作為碳源，將NH3氧化成硝酸鹽并獲得能量用于細(xì)胞生長(zhǎng)；而異養(yǎng)硝化微生物必須利用有機(jī)碳獲得能量才能將不同形態(tài)的氮元素氧化為硝酸鹽和亞硝酸鹽[37-38]。有研究利用乙炔抑制法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證明硝化作用是以自養(yǎng)微生物的作用為主，異養(yǎng)微生物為輔[39]，但是有研究表明異養(yǎng)硝化微生物在特定的條件如好氧環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生大量的N2O，并遠(yuǎn)高于自養(yǎng)硝化作用[40]。目前，硝化作用的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中一般以亞硝酸鹽和硝酸鹽以及產(chǎn)生氣體的量來(lái)確定，由于硝化反硝化作用的同時(shí)存在會(huì)使以上產(chǎn)物消耗，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確[41]。關(guān)于異養(yǎng)硝化作用在好氧條件下的反應(yīng)機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。

2.2 反硝化作用及關(guān)鍵微生物

反硝化作用即脫氮作用，是影響全球氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，反硝化作用不僅造成氮肥的損失，又被認(rèn)為是土壤產(chǎn)生N2O的主要途徑之一。反硝化作用在缺少氧氣的條件下進(jìn)行，分為4步：（1）NO3?在基因編碼的硝酸鹽還原酶的作用下還原為NO2?；（2）NO2?在基因編碼的亞硝酸鹽還原酶的作用下還原為NO；（3）NO在基因編碼的NO還原酶的作用下還原為N2O；（4）N2O在基因編碼的N2O還原酶的作用下還原為無(wú)害的N2[40]。其中氮以NO、N2O、N2的形式釋放出來(lái)，造成了農(nóng)田土壤氮素的流失。

反硝化過(guò)程由占土壤總細(xì)菌數(shù)量0.1%～5.0%的兼性厭氧細(xì)菌主導(dǎo)。有研究采用15N同位素標(biāo)記法測(cè)得在60％的土壤孔隙（water-filled pore space；WFPS）充水時(shí)，反硝化作用為N2O的主要來(lái)源[41]。說(shuō)明在常規(guī)水分條件的土壤中，反硝化作用主導(dǎo)了N2O排放。N2O還原酶活性會(huì)受到氧氣的暫時(shí)抑制，隔離氧氣后，N2O還原酶會(huì)在0.7～3h內(nèi)恢復(fù)。反硝化微生物廣泛分布于假單胞菌（）、芽孢桿菌（）、鹽桿菌（）、根瘤菌（）、紅螺菌（）、脫氮副球菌（）、嗜纖維菌（）等細(xì)菌種屬，除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)真菌也可以參與反硝化作用，在特定的生態(tài)系統(tǒng)中參與反硝化作用的還有古菌以及放線菌[42]，因此，對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)反硝化作用的研究也應(yīng)該將細(xì)菌以外的微生物考慮在內(nèi)。目前，對(duì)反硝化作用有關(guān)的功能基因（G，A，K，S，B和Z）的研究已經(jīng)有了大量的應(yīng)用[43-44]。N2O排放量與K、S和Z等具有顯著相關(guān)性，并且反硝化菌中存在缺失Z基因的種類，這類反硝化菌不能產(chǎn)生N2O還原酶，進(jìn)行反硝化作用是不完全的，N2O直接被釋放出來(lái)并且不會(huì)還原成N2[45]。此外，某些硝化微生物可以發(fā)生反硝化作用產(chǎn)生N2O，這些硝化微生物的反硝化作用通常在低氧環(huán)境中發(fā)生，首先將NH3氧化成NO2?，然后將NO2?還原成N2O或N2[27]。研究表明，硝化微生物的反硝化作用可能是潛在的N2O生成來(lái)源，并且對(duì)反硝化作用具有一定的貢獻(xiàn)[45]。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于反硝化作用對(duì)N2O的貢獻(xiàn)已有大量研究，但參與反硝化作用的微生物種類繁多，并且多數(shù)微生物的作用機(jī)理和基因序列是未知的[46]。今后應(yīng)加強(qiáng)分子生物學(xué)技術(shù)在反硝化作用研究中的應(yīng)用，并對(duì)N2O排放相關(guān)的反硝化微生物種類進(jìn)行區(qū)分，加強(qiáng)對(duì)相關(guān)功能基因的準(zhǔn)確鑒定。

2.3 土壤N2O產(chǎn)生的其它途徑

硝化與反硝化作用是自然界中氮素循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)力，釋放了占土壤總釋放量約70%的N2O。除此之外，硝酸鹽異化還原成銨（DNRA）以及“共同反硝化”作用等也會(huì)產(chǎn)生N2O。

DNRA作用是指NO3?在厭氧條件下被微生物異化還原成NH4+的過(guò)程[47]。DNRA過(guò)程分為兩步反應(yīng)，首先在硝酸鹽還原酶的作用下，將NO3?還原成NO2?；然后在亞硝酸還原酶的催化下將NO2?轉(zhuǎn)化為NH4+。DNRA過(guò)程不但將NO3?轉(zhuǎn)化為NH4+，還產(chǎn)生了N2O[27]。在對(duì)專性厭氧細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌、好氧細(xì)菌和真菌等的研究中都發(fā)現(xiàn)了DNRA過(guò)程[48]。研究表明[49-50]，農(nóng)田土壤中反硝化作用是NO3?異化還原的主要過(guò)程，在草地、森林等高碳氮比的土壤環(huán)境中，DNRA對(duì)氮素轉(zhuǎn)化以及N2O排放具有重大作用。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)在草地、森林等土壤環(huán)境中，許多真菌能將NO2?與氮化合物中的氮原子結(jié)合產(chǎn)生N2O，該過(guò)程與一般的反硝化作用不同，被稱為“共同反硝化”，但共同反硝化對(duì)N2O排放的作用機(jī)理至今還有許多未知[51]。章偉等研究表明，真菌在酸性森林土壤中活性是細(xì)菌的2倍[38]，并且真菌進(jìn)行的硝化反硝化作用產(chǎn)生了與細(xì)菌等量甚至更多的N2O[52-53]。Herold等[54]研究表明，真菌的反硝化作用貢獻(xiàn)顯著，并且真菌的生物量在不同梯度土壤中較穩(wěn)定，因此，對(duì)N2O排放量的計(jì)算不能忽略真菌的作用[39]。而關(guān)于真菌在農(nóng)田土壤氮循環(huán)中的作用以及真菌的硝化反硝化作用對(duì)農(nóng)田土壤N2O排放還需要進(jìn)一步研究。

此前研究多將N2O排放的貢獻(xiàn)來(lái)源簡(jiǎn)單區(qū)分為硝化作用和反硝化作用，且由于研究手段有限，不能很好地區(qū)分這兩種作用對(duì)N2O排放的貢獻(xiàn)，使硝化作用和反硝化作用的貢獻(xiàn)常常被高估或者低估，導(dǎo)致對(duì)農(nóng)田土壤N2O排放機(jī)理理解不夠全面，在今后的研究工作中還需要探索新的試驗(yàn)方法，深入研究農(nóng)田土壤中不同微生物利用氮素的不同過(guò)程以及N2O的產(chǎn)生機(jī)制及其排放貢獻(xiàn)。

3 生物炭對(duì)土壤N2O產(chǎn)生途徑的影響

3.1 生物炭對(duì)硝化作用的影響

土壤的硝化作用受土壤類型、通氣條件、含水量、溫度、土壤pH和底物氮濃度等多因素的影響，土壤中添加生物炭有可能通過(guò)改變土壤性狀使與N2O產(chǎn)生相關(guān)的硝化菌群的生存環(huán)境發(fā)生改變，從而對(duì)硝化作用產(chǎn)生N2O過(guò)程起到促進(jìn)或抑制作用。研究表明，在土壤中添加生物炭后提高了土壤pH值[55-56]，而pH的提高對(duì)AOA（氨氧化細(xì)菌）和AOB（氨氧化古菌）的生長(zhǎng)繁殖會(huì)有一定影響，從而影響硝化作用。Ball等[57]研究認(rèn)為，在酸性林地土壤中添加生物炭后，AOB菌群數(shù)量明顯提高，土壤中硝化速率也明顯提高。Taketani等[58]研究表明，在施用生物炭的土壤中，AOA的多樣性降低，但是拷貝數(shù)顯著提高，而AOB的多樣性和基因拷貝數(shù)則均明顯提高。由于生物炭的表面多孔，能夠吸附并儲(chǔ)存水和養(yǎng)分，這樣可以為土壤微生物特別是細(xì)菌提供良好的棲息條件，從而提高AOB和AOA等菌群的豐度，使相應(yīng)的土壤硝化過(guò)程加快[59-60]。但研究結(jié)果也不盡一致，如He等[61]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭對(duì)AOA基因拷貝數(shù)的影響很小或表現(xiàn)為降低，這種豐度差異多為pH導(dǎo)致的，AOA在酸性條件下更能發(fā)揮主導(dǎo)作用。N2O的產(chǎn)生沒(méi)有增加，反而下降，可能的原因是生物炭的吸附作用固定了一部分N2O。另外，Kookana研究認(rèn)為，某些酚類化合物會(huì)抑制硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)[62]，因此，當(dāng)土壤中加入生物炭后，酚類化合物被生物炭吸附使其在土壤中的濃度下降，從而減少了酚類化合物對(duì)硝化作用造成負(fù)面影響的機(jī)會(huì)，對(duì)土壤微生物硝化過(guò)程具有強(qiáng)化作用[63]。還有研究認(rèn)為，生物炭可通過(guò)吸附底物來(lái)降低微生物的活性，并影響異養(yǎng)微生物如AOB的活性，所以當(dāng)NH4+被吸附或固定后，土壤中的氨化作用下降從而也抑制了微生物的硝化作用[64]。Yoo等[65]在水稻土壤中添加生物炭發(fā)現(xiàn)，土壤中微生物量碳增加了84%～119%，N2O排放明顯增加，說(shuō)明生物炭通過(guò)調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì)提高了微生物的代謝效率，刺激了硝化作用產(chǎn)生N2O。

總之，目前針對(duì)生物炭減少硝化作用N2O排放的研究主要集中在添加生物炭后土壤理化性質(zhì)的改變[66]以及硝化作用相關(guān)功能基因豐度變化等方面，有關(guān)生物炭對(duì)土壤硝化作用產(chǎn)生N2O的響應(yīng)仍存在爭(zhēng)議，還缺乏影響機(jī)理方面的研究。

3.2 生物炭對(duì)反硝化作用的影響

反硝化作用不僅造成氮肥的損失，又被認(rèn)為是土壤產(chǎn)生N2O的主要途徑。近年來(lái)，關(guān)于生物炭施入土壤后能夠降低N2O排放這一結(jié)果，引起了科研人員的高度重視[67]。研究表明，在農(nóng)田土壤中添加生物炭可以改善土壤通氣狀況，并抑制厭氧反硝化微生物的反硝化作用，使N2O排放減少[68]。但也有研究認(rèn)為，施用生物炭后，土壤N2O排放反而增加[69]。

生物炭對(duì)反硝化作用的影響主要有以下幾種解釋：（1）生物炭改變了土壤理化性質(zhì)。生物炭C/N比較高，并且結(jié)構(gòu)多孔，在土壤中有利于氣體流通，抑制了土壤微生物反硝化作用，降低了N2O排放[70]。（2）生物炭減少了反硝化菌活動(dòng)。在氮素缺乏、有機(jī)質(zhì)較低的土壤中添加生物炭后，會(huì)明顯降低土壤中硝態(tài)氮與有機(jī)質(zhì)的含量，從而導(dǎo)致反硝化菌活動(dòng)減少，N2O釋放受到抑制[71]。（3）生物炭可以誘發(fā)氮素的固定。研究發(fā)現(xiàn)，生物炭制作溫度越高，水稻土N2O釋放量有逐漸減少的趨勢(shì)，可能原因是誘發(fā)氮素固定，由此減少了N2O的排放[72]。（4）生物炭的吸附作用。生物炭顆粒不僅可以吸附游離的NH4+，還能減少土壤中的游離NO3?，從而抑制反硝化作用中N2O的釋放[73]。（5）土壤中固氮微生物數(shù)量的增加。生物炭的施入，使固氮微生物的數(shù)量增加，導(dǎo)致氮的反硝化作用減少，從而起到了降低N2O排放的作用[74]。

Harter等發(fā)現(xiàn)，在輕微堿性砂質(zhì)土壤中，盡管生物炭添加刺激了反硝化基因表達(dá)，增加了反硝化作用，但N2O排放也隨之減少了，這是因?yàn)樯锾繉?duì)水分飽和情況下土壤孔隙中的N2O進(jìn)行了吸附，從而刺激了Z編碼的細(xì)菌N2O還原酶活性和其它N2O還原劑對(duì)N2O的還原[75]。調(diào)查土壤生物炭施用是否影響攜帶典型和非典型的Z基因的微生物群落的組成有助于解釋該現(xiàn)象[76]。研究表明，Z的表達(dá)水平是決定N2O是否被還原成無(wú)害的N2的關(guān)鍵因素[77]。Cayuela等[78]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭在15種不同農(nóng)業(yè)土壤中普遍降低了N2O/(N2O+N2)比例，說(shuō)明生物炭刺激了反硝化最后一步反應(yīng)將N2O還原為N2。與之相比，Ameloot等[79]在生物炭是否能夠促進(jìn)土壤反硝化作用的研究中，并未觀察到N2O/(N2O+N2)比例降低，即生物炭不能促進(jìn)N2O還原為N2，可能原因是該土壤中缺少含有N2O還原酶基因的反硝化菌[80]。

4 問(wèn)題和展望

區(qū)分硝化作用與反硝化作用對(duì)產(chǎn)生N2O的貢獻(xiàn)的方法有多種，其中同位素標(biāo)記法結(jié)合乙炔抑制技術(shù)能夠?qū)ψ责B(yǎng)硝化作用、異養(yǎng)硝化作用和反硝化作用進(jìn)行區(qū)分，是目前研究硝化反硝化作用對(duì)N2O產(chǎn)生貢獻(xiàn)，以及探明生物炭對(duì)硝化反硝化作用響應(yīng)機(jī)理的最精確的實(shí)驗(yàn)方法。

目前對(duì)硝化反硝化作用產(chǎn)生N2O機(jī)理的研究還不夠完善，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下得到的結(jié)果也不盡相同，對(duì)農(nóng)田土壤N2O排放的研究存在局限性和地域性，還需進(jìn)一步研究如何減少農(nóng)田溫室氣體排放、土壤氮素?fù)p失等帶來(lái)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

生物炭對(duì)土壤硝化反硝化作用表現(xiàn)出極大的復(fù)雜性，有研究表明其通過(guò)吸附作用起到的減排作用存在上限[81]。Verhoeven等[82]研究表明，生物炭提高土壤pH，但并未影響N2O的排放。亦有研究表明，富含鐵的生物炭能夠刺激硝酸鹽、亞硝酸鹽、N2O的非生物轉(zhuǎn)化[83]。眾多研究得出不同甚至相反的結(jié)論，說(shuō)明生物炭應(yīng)用仍有爭(zhēng)議?，F(xiàn)有研究對(duì)土壤硝化反硝化過(guò)程的微生物豐度、群落結(jié)構(gòu)以及N2O排放的微生物學(xué)機(jī)制仍然缺乏了解。

有研究認(rèn)為，生物炭對(duì)氮循環(huán)和N2O的減排作用可能是偶然的，不能起到長(zhǎng)期作用[84]。生物炭雖然改變氮循環(huán)、土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)，但對(duì)N2O減排只有微小且短暫作用，這或許與生物炭的材質(zhì)有關(guān)，不同材質(zhì)生物炭和各種類型土壤組合存在著特異性，對(duì)生物炭特性及其與土壤相互作用機(jī)理認(rèn)知的不完整，阻止了生物炭的發(fā)展[85]，未來(lái)應(yīng)從以下方面加強(qiáng)對(duì)生物炭的研究：生物炭各種理化性質(zhì)如表面積、粒徑、孔隙度、陽(yáng)離子交換能力等；生物炭的生產(chǎn)條件如生物炭的原料、生產(chǎn)溫度、熱解氣壓、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及有機(jī)物含量等；生物炭與土壤環(huán)境的搭配性如氣候條件、耕作條件和作物種類等[86-88]。還應(yīng)繼續(xù)在各領(lǐng)域開(kāi)發(fā)生物炭的利用價(jià)值，以利于其推廣使用。

隨著科技的不斷發(fā)展，各學(xué)科的交叉融合是當(dāng)今科學(xué)研究的重要手段。分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用與基因組測(cè)序的普及，極大地提高了人們對(duì)土壤微生物的認(rèn)知，越來(lái)越多的功能基因的發(fā)現(xiàn)也對(duì)微觀機(jī)理的認(rèn)知提供了很好的研究機(jī)遇。在未來(lái)的研究中，對(duì)現(xiàn)有研究技術(shù)的改進(jìn)，以及新研究技術(shù)的開(kāi)發(fā)利用將有助于完善土壤硝化反硝化微生物研究的理論體系。生物炭的減排機(jī)制研究還存在很多不可控因素，表現(xiàn)出多種不同的研究結(jié)果，后續(xù)研究應(yīng)該利用長(zhǎng)期定位實(shí)驗(yàn)，以及在不易受干擾的系統(tǒng)中進(jìn)行微觀實(shí)驗(yàn)等多種實(shí)驗(yàn)手段，研究土壤硝化和反硝化對(duì)生物炭施用的響應(yīng)機(jī)理。

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Nitrification and Denitrification and its Response to Biochar Addition in AgriculturalSoil：A Review

ZHAO Guang-xin1,2, ZHANG Qing-wen2, LIU Xing-ren2, TIAN Xiu-ping1

（1. College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agricultural, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081）

Nitrous oxide (N2O) is one of the most important greenhouse gases, and agriculture soils are the main emission sources. Nitrification and denitrification, which are dominated by microbes, are the most important emission pathways. Therefore, the soil nitrification and denitrification have been paid much attention by scientists. Based on a large quantity of literatures, this paper summarizes the methods of distinguishing the contribution of nitrification and denitrification to N2O emission, soil N2O production pathway and its influencing factors, and mechanism of the effects of biochar on N2O emission. The results showed that the response of nitrification and denitrification to biochar was different, and there was still a lot of uncertainty in the effect of biochar on N2O emission reduction. The underlying mechanism was not yet clear. As such, this paper proposed the best research method to distinguish the contribution of nitrification and denitrification to N2O emission. Finally, the research prospect of the influencing factors of nitrification and denitrification and the response mechanism of biochar in farmland soil were also proposed.

Nitrous oxide; Nitrification inhibitor; Soil microbe; Functional gene

10.3969/j.issn.1000-6362.2018.07.002

趙光昕,張晴雯,劉杏認(rèn),等.農(nóng)田土壤硝化反硝化作用及其對(duì)生物炭添加響應(yīng)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,2018,39(7):442-452

2017?11?29

。E-mail：liuxr1976@126.com；tian5918@sohu.com

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)（2015ZX07203-007）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41773090；31300375）

趙光昕（1991?），碩士生，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)。E-mail：zgxzhao@126.com