5株植物根際促生菌對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng) 和品質(zhì)的影響

李昌寧，李政璇，曹全熙，李建宏，姚拓，冉福，馮影

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè) 可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省外資項(xiàng)目管理辦公室，甘肅 蘭州 730030；3.和政縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，甘肅 臨夏 731299)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界各國(guó)廣泛種植的優(yōu)良豆科牧草，具有生長(zhǎng)快、生物量大和對(duì)不良環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特性，應(yīng)用前景非常廣闊[1]。紫花苜蓿作為我國(guó)畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革發(fā)展的一種重要飼草，近年來(lái)種植面積不斷增加，另一方面，紫花苜蓿雖然具有與根瘤菌共生結(jié)瘤固氮的能力，但其生物固氮過(guò)程也需要磷素的參與，因此，其種植過(guò)程對(duì)磷肥的需求量較高，磷礦是一種不可再生資源，我國(guó)磷礦儲(chǔ)量少，嚴(yán)重依賴國(guó)外進(jìn)口，大量的磷肥使用在增加紫花苜蓿生產(chǎn)成本的同時(shí)，對(duì)食品及環(huán)境安全也帶來(lái)隱患，還會(huì)導(dǎo)致土壤板結(jié)、肥力下降、作物的收益率減少、甚至耕地退化，單靠化肥來(lái)提高苜蓿的產(chǎn)量已不能滿足可持續(xù)發(fā)展的理念需求[2]。據(jù)2013年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的化肥年使用量已達(dá)4 637萬(wàn)t，占世界化肥施用總量的35%。按播種面積計(jì)算，平均化肥使用量達(dá)到400 kg/hm2，是美國(guó)的4倍，是發(fā)達(dá)國(guó)家化肥安全施用上限(225 kg/hm2)的2倍，另一方面，我國(guó)的化肥有效利用率很低，每年農(nóng)用化肥的60%～70%進(jìn)入環(huán)境[3]。2015年全國(guó)化肥用量為6 022.6萬(wàn)t，與2013年相比，化肥年均增長(zhǎng)率為14.9%，農(nóng)業(yè)部2015年2月出臺(tái)了“到2020年化肥使用量零增長(zhǎng)行動(dòng)方案”，因此，以微生物肥源替代化肥的研究引起了研究者的廣泛關(guān)注，其中植物根際促生細(xì)菌(Plant growth promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR)的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一[4-6]。

植物根際促生菌是指自由生活在土壤或附生于植物根際的一類可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量、改良土壤的細(xì)菌[7-8]。李丹等[9]使用含有PGPR的菌肥可使黃瓜產(chǎn)量提高85.3%、維生素C含量提高36.6%，畸形率降低42.4%；使用微生物肥料后，可增加煙草株高，降低病蟲(chóng)害，增加經(jīng)濟(jì)效益[10]；土壤中水分含量、有機(jī)質(zhì)、速效氮、有效磷和有效鉀的含量會(huì)增加，土壤微生物的數(shù)量也會(huì)增加[11]。雖然苜蓿根系有大量的根瘤可為其提供一定的氮素營(yíng)養(yǎng)，但對(duì)磷素依賴性較大，目前苜蓿生產(chǎn)的磷肥年使用量為900 kg/hm2，有的高達(dá)1 350 kg/hm2，且磷素是苜蓿結(jié)根瘤的必需元素，直接影響到根瘤數(shù)量及固氮效率[12]。PGPR可以把土壤中不能被植物利用的無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化為植物能利用的有機(jī)磷，促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)和生長(zhǎng)[13]。

微生物肥料研制與應(yīng)用我國(guó)始于20世紀(jì)40年代，首次在大豆根部接種根瘤菌；50年代早期研究了根瘤菌在內(nèi)的固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌等細(xì)菌性肥料；60年代推出了“5406”放線菌抗生菌肥料；70～80年代中期研究土壤真菌制成的孢囊；90年代后，逐漸出現(xiàn)溶磷、解鉀、促生和生防等產(chǎn)品[14]。試驗(yàn)利用課題組前期篩選出的PGPR菌株為材料，以盆栽方式驗(yàn)證其對(duì)苜蓿生長(zhǎng)和品質(zhì)的影響，以期為PGPR的應(yīng)用和推廣提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 Gnyt1、Jm92、Lx191、LSH11、Jm170等均為課題組前期研究中積累的優(yōu)良菌株材料，其特性見(jiàn)表1。

表1 菌株特性

1.1.2 供試苜蓿種子 供試紫花苜蓿品種為甘農(nóng)三號(hào)，種子市售。

1.1.3 供試土壤 供試土壤采挖自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，加入少量蛭石備用。將準(zhǔn)備好的混有蛭石的土壤過(guò)3 mm的土壤篩，輻照滅菌(委托蘭州綠源輻照有限責(zé)任公司完成)，裝入已消毒的花盆(直徑18 cm，深19 cm)備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)為分別接種Jm92、Lx191、LSH11、Jm170、Gnyt1菌液和滅菌的溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)液(CK)共6個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)。挑選飽滿、無(wú)破損的種子，30%雙氧水表面消毒5 min，無(wú)菌水浸泡2 h，然后置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽處理，發(fā)芽后挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行栽培。每盆栽培15株，栽培7 d后選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，每盆留苗10株。將活化后的菌株接種于LB培養(yǎng)液，180 r/min，28℃培養(yǎng)，血球計(jì)數(shù)板檢驗(yàn)菌體濃度，培養(yǎng)36 h，待菌體濃度達(dá)到108cfu/mL時(shí)終止培養(yǎng)，用移液槍吸取培養(yǎng)液，滴加到幼苗根部，每苗加2 mL，置于室溫、自然光下培養(yǎng)，定期澆水。待種子成熟期測(cè)定植株的株高、莖粗及粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)的含量。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

株高采用卷尺測(cè)定，以土壤到枝條最高處的絕對(duì)高度表示[19]；莖粗采用游標(biāo)卡尺測(cè)定，以莖基部距土壤5 cm處的粗度表示[19]。待種子成熟期，距土壤5 cm處將花盆內(nèi)10株苜蓿全部刈割，放置于烘箱121℃殺青30 min，60℃干燥48 h至恒重后，用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)100目篩網(wǎng)，粉碎后混合均勻，對(duì)苜蓿營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，粗蛋白采用半微量凱氏定氮法測(cè)定；粗脂肪采用索氏抽提法測(cè)定；酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維采用范式纖維素法測(cè)定[20]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Excel 2010軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物根際促生菌對(duì)苜蓿生長(zhǎng)的影響

促生菌株對(duì)苜蓿株高的影響十分明顯，與對(duì)照相比株高增加11.2%～75.2%(圖1)。不同菌株促生能力大小不同，促生菌劑處理的苜蓿株高都有不同程度的增加(P<0.05)。不同促生菌劑處理對(duì)苜蓿株高影響的大小順序?yàn)镚nyt1>Jm92>Lx191>LSH11>Jm170>CK，菌株Gnyt1、Jm92對(duì)苜蓿株高的促進(jìn)作用極為明顯(P<0.05)，分別是CK的75.2%、59.6%，表明Gnyt1、Jm92能夠明顯促進(jìn)苜蓿的株高。其次是菌株Lx191，使株高增加30.0%。

菌株可增加苜蓿莖粗4.1%～22.2%，對(duì)苜蓿莖粗的影響趨勢(shì)和株高類似(圖2)，但沒(méi)有株高明顯。使用不同促生菌劑后，對(duì)莖粗的影響各不相同。除Jm92與Lx191之間差異不顯著外(P>0.05)，其余各處理均差異顯著(P<0.05)，各菌劑處理對(duì)苜蓿莖粗促進(jìn)效果最明顯的是Gnyt1，較CK增加22.2%；Jm92、Lx191與Jm170次之，增幅分別為15.6%、14.0%、8.7%；而菌劑Jm170處理效果最差，莖粗較CK增加4.1%。

圖1 接種菌株處理下苜蓿的株高Fig.1 The effect of PGPR strain on plant height

圖2 接種菌株處理下苜蓿的莖粗Fig.2 The effect of PGPR strain on stem diameter

2.2 菌株對(duì)苜蓿品質(zhì)的影響

各菌劑處理均能提高苜蓿粗蛋白含量(圖3)，粗蛋白含量在19.3%～21.9%，比對(duì)照增加15.3%～20.1%。不同菌劑對(duì)苜蓿粗蛋白影響的大小順序?yàn)镚nyt1>LSH11>Jm170>Lx191>Jm92>CK，各處理間差異顯著(P<0.05)。經(jīng)菌劑Gnyt1處理的苜蓿對(duì)粗蛋白促進(jìn)作用最明顯，與CK相比增加20.1%，其次，由LSH11，Lx191和Jm170處理，粗蛋白含量分別增加了15.3%，11.2%和11.8%，而Jm92處理的粗蛋白含量增加6.0%，效果最弱。

各菌劑處理的苜蓿粗脂肪含量均有明顯提高(圖4)，粗脂肪含量增加3.8%～12.7%(P<0.05)。其中Gnyt1處理效果最好，與對(duì)照相比提高12.7%(P<0.05)；其次是Jm92和LSH11，分別提高10.0%、9.4%；而Jm170和Lx191較弱，分別提高5.9%和3.8%。

圖3 接種菌株處理下苜蓿的粗蛋白含量Fig.3 The effect of PGPR strains on crude protein content

圖4 接種菌株處理下苜蓿的粗脂肪含量Fig.4 The effect of PGPR strains on crude fat content

各菌劑處理對(duì)NDF抑制作用顯著(圖5)，NDF含量在40.2～41.5，各菌劑較CK減少1.4%～4.4%(P<0.05)，其中Gnyt1，LSH11和Jm170較對(duì)照相比抑制作用明顯，減少量分別為4.4%，3.3%和3.0%，而Jm92和Lx191較弱，減少量分別為2.1%、1.4%。不同菌劑對(duì)苜蓿NDF抑制作用的大小順序?yàn)镚nyt1>LSH11>Jm170>Jm92>Lx191>CK，各菌劑處理均能抑制苜蓿NDF的形成，提高苜蓿品質(zhì)。

經(jīng)促生菌劑處理后苜蓿的ADF含量明顯減少，ADF含量為27.5%～28.2%(圖6)，減少17.5%～37.8%。不同菌劑處理對(duì)苜蓿ADF含量減少的大小順序?yàn)镚nyt1>Jm92>Jm170>LSH11>Lx191>CK，Gnyt1、Jm92對(duì)苜蓿ADF減少作用明顯，分別減少了37.8%、35.5%；其次是Jm170和LSH11處理的苜蓿，減少22.0%、21.4%；而Lx191對(duì)ADF減少量為17.5%，減少作用較弱。

圖5 接種菌株處理下苜蓿的NDF含量Fig.5 The effect of PGPR strains on NDF content

圖6 接種菌株處理下苜蓿的ADF含量Fig.6 The effect of PGPR strains on ADF content

3 討論

3.1 菌株對(duì)苜蓿株高和莖粗的影響

試驗(yàn)所用的PGPR菌株對(duì)苜蓿株高和莖粗均有促進(jìn)作用(P<0.05)，株高和莖粗分別增加11.2%～75.2%、4.1%～22.2%。菌株對(duì)苜蓿莖粗的影響趨勢(shì)和株高類似，但沒(méi)有株高明顯。這是由于植物的生長(zhǎng)尤其是苜蓿，其伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的幅度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于橫向生長(zhǎng)，總體而言，研究采用的5株促生菌促進(jìn)苜蓿株高和莖粗是協(xié)同增長(zhǎng)。施用PGPR菌劑后，不僅使定殖在植物根際的PGPR菌群數(shù)量大幅增加，其代謝過(guò)程中分泌的乳酸、延胡索酸、蘋果酸等降低了土壤局部的pH，使一些難溶性磷酸鹽在酸性條件下分解；還使一些與有機(jī)酸結(jié)合的金屬離子(如Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+)發(fā)生絡(luò)合或鰲合，減少了易與磷酸根結(jié)合的金屬陽(yáng)離子，使磷酸根離子被釋放出來(lái)[21]。當(dāng)土壤中有效磷增加后，側(cè)根以及根毛可加快對(duì)磷元素的吸收，促進(jìn)根系發(fā)育，增加紫花苜蓿的根瘤數(shù)，從而促進(jìn)苜蓿株高和莖粗的生長(zhǎng)[22]，這跟溶磷菌與根瘤菌之間的互作效應(yīng)是密不可分的。馬文彬等[13]研究表明，單菌株制備的接種劑可使箭筈豌豆地上生物量顯著增加，與試驗(yàn)研究結(jié)果具有一定的相似性。

除了溶磷作用能外，還應(yīng)注意到，研究采用的Gnyt1、Jm92、LSH11、Jm170等4株菌還有分泌IAA等植物激素的能力，其分泌的植物激素(如IAA)也能刺激苜蓿生長(zhǎng)，李玉娥等[23]利用分泌IAA能力的菌株處理苜蓿后，第1茬各處理株高較對(duì)照分別增加19.0%～43.9%，莖增粗75.2%～80%；Molla M[24]研究表明PGPR合成的IAA能提高植物體內(nèi)部α-淀粉酶的活性，將可溶性淀粉分解成糖類來(lái)促進(jìn)植物發(fā)芽，而苜蓿的發(fā)芽部位主要是未成熟的種子、胚芽鞘、莖尖、根尖分生組織等生長(zhǎng)旺盛的部位，同時(shí)這些部位也是植物體內(nèi)產(chǎn)生IAA的主要組織和器官；本研究中苜蓿株高、莖粗的增加，可能是接種的PGPR菌株分泌的IAA提高了苜蓿幼苗活力，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。苜蓿幼苗形態(tài)發(fā)育將影響作物的生長(zhǎng)及對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，對(duì)苜蓿株高和莖粗有促進(jìn)作用[4]。

3.2 菌株對(duì)苜蓿品質(zhì)的影響

苜蓿營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)是評(píng)價(jià)菌劑施用效果的重要指標(biāo)。管鵬[7]研究發(fā)現(xiàn)使用單一PGPR菌肥與對(duì)照相比苜蓿CP含量增幅為6.69%～25.11%；韓華雯等[15]接種PGPR菌肥使苜蓿EE含量與對(duì)照相比減少1.31%～7.04%(第1茬)；Vessey[26]報(bào)道，PGPR菌肥通過(guò)一系列復(fù)雜的機(jī)制增加植物根際養(yǎng)分的有效性、產(chǎn)生嗜鐵素、輔助其他主要共生關(guān)系等，使苜蓿的粗蛋白質(zhì)更好的積累，同時(shí)粗纖維的生成受到抑制，提高了苜蓿品質(zhì)。通過(guò)對(duì)紫花苜蓿接種不同PGPR菌劑后，苜蓿CP、EE的含量明顯增加，ADF、NDF含量減少。說(shuō)明PGPR菌肥通過(guò)一系列復(fù)雜的機(jī)制，能夠促進(jìn)CP、EE的合成代謝，抑制ADF和EDF的合成，在顯著提高苜蓿干草產(chǎn)量的同時(shí)也能有效改善苜蓿干草的品質(zhì)，最終實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的雙重目標(biāo)。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同PGPR菌劑改善紫花苜蓿品質(zhì)的效果不同，這與不同菌株溶磷以及分泌植物激素能力不同有關(guān)，磷素的供給水平還可以影響紫花苜蓿生物固氮的效率，而磷素及氮素的含量與葉綠素含量存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，葉綠素含量直接影響著植物的凈光合速率和光合產(chǎn)物的形成[27]，從而影響植株中蛋白質(zhì)和脂肪的含量。因此，當(dāng)促生菌溶磷能力有差異時(shí)，其對(duì)宿主植物的固氮能力以及光合效率均會(huì)產(chǎn)生不同的影響。

4 結(jié)論

PGPR菌劑能夠改善紫花苜蓿品質(zhì)，促進(jìn)生長(zhǎng)，以菌株Gnyt1效果最佳，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的潛力，此次研究同時(shí)為西北干旱、半干旱區(qū)使用PGPR菌肥獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)苜蓿提供了理論依據(jù)。