膽管細(xì)胞癌組織S100A6 mRNA及其蛋白表達(dá)變化*

李福榮，牛福勇，李華

膽管細(xì)胞癌是指發(fā)生于肝內(nèi)膽管的癌腫，屬原發(fā)性肝癌的一種[1]。膽管細(xì)胞癌的病因至今尚不清楚，已有報道指出膽道慢性炎癥和感染、膽管或膽囊結(jié)石的慢性刺激、潰瘍性結(jié)腸炎、先天性膽管囊腫、肝吸蟲感染、膽道手術(shù)史、原發(fā)性硬化性膽管炎、乙型肝炎病毒感染、膽管癌基因突變等因素與膽管癌發(fā)生密切相關(guān)[2-4]。近年來，膽管細(xì)胞癌的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)有升高的趨勢。隨著影像學(xué)檢查手段和膽管細(xì)胞癌相關(guān)生物分子的檢測對膽管癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)及預(yù)后判斷方面取得了重要的進(jìn)展。S100鈣結(jié)合蛋白 A6（S100 calcium-binding protein A6，S100A6）是 S100 家族成員，主要通過與Ca2+以及靶向蛋白相互作用，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖及分化等過程[5，6]。有研究報道指出，有效沉默S100A6基因可有效抑制食管癌細(xì)胞的增殖和遷移能力[7]，而在結(jié)腸癌，S100A6的表達(dá)對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的促進(jìn)作用[8]。本研究檢測了膽管細(xì)胞癌組織S100A6 mRNA水平及其蛋白表達(dá)的變化，并分析了其與實(shí)驗室檢測指標(biāo)和臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2008年1月～2014年12月在我院接受手術(shù)切除、術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)的膽管細(xì)胞癌患者40例，男26例，女14例；年齡39～79歲，平均年齡（59.68±14.53）歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）標(biāo)準(zhǔn)對膽管細(xì)胞癌組織進(jìn)行TNM分期，根據(jù)Lauren's分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)分型。TNM分期：I期12例，II期16例，III期12例；腫瘤分化：高分化7例，中分化19例，低分化14例。排除伴有心、肺、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病患者。選擇同期在本院就診的膽道良性疾病患者40例作為對照，男22例，女18例；年齡37～80歲，平均年齡（58.77±14.68）歲。包括膽囊結(jié)石18例，膽囊息肉12例，急性胰腺炎2例，慢性膽囊炎8例。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，由直系親屬簽署知情同意書。隨訪截止日期為2015年12月31日。

1.2 組織S100A6 mRNA及其蛋白檢測 自-80℃低溫冰箱中取出待檢的膽管細(xì)胞癌組織、癌旁組織、肝組織25～40 mg，按照RNA提取試劑盒（Omega公司）說明書要求提取總RNA，并以此為底物進(jìn)行Real-time PCR。引物，S100A6 F:5'-CTCACCATTGGCTCGAAGCT-3'，R:5'-GTTCACCTCCTGGTCCTTGTTC-3'；GAPDH F:5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，R:5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。擴(kuò)增條件為:95℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 退火30 s，72℃30 s，30個循環(huán)。以△Ct(目的基因)-△Ct（內(nèi)參基因）計算實(shí)驗組和對照組的△Ct，按照△△Ct=△Ct（實(shí)驗組）-△Ct（對照組）計算mRNA相對水平的差值，即2-△△Ct。提取各組織蛋白，測定蛋白濃度。常規(guī)行Western blot（一抗、二抗購自Sigma公司），主要包括蛋白質(zhì)樣品獲得、考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白、SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)移、免疫反應(yīng)等過程。以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白GAPDH的積分吸光度比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3 血清S100A6水平、血常規(guī)、血生化和腫瘤指標(biāo)檢測 采用ELISA法檢測血清S100A6（美國R&D systems公司）；使用深圳雷杜公司RT7200全自動血液分析儀和日本奧林巴斯公司AU2700型全自動生化分析儀檢測血常規(guī)、生化指標(biāo)和CA125、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、C反應(yīng)蛋白（CRP）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗。采用Spearman秩相關(guān)分析。采用非條件Logistic回歸單因素或多因素分析。多分類變量以啞變量形式進(jìn)入回歸模型，變量入選標(biāo)準(zhǔn)為α≤0.05，剔除標(biāo)準(zhǔn)為α＞0.05。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同組織S100A6 mRNA及其蛋白表達(dá)情況 在40例癌旁組織和肝組織中，S100A6蛋白分別陽性8例（20%）和12例（30%），顯著低于肝內(nèi)膽管癌組織的 26例（65%，P＜0.05）；癌旁組織和肝組織 S100A6 mRNA相對水平顯著低于肝內(nèi)膽管癌組織（P＜0.05）；癌旁組織和肝組織S100A6蛋白相對表達(dá)量顯著低于肝內(nèi)膽管癌組織（P＜0.05，表1）。

表1 不同組織S100A6 mRNA及其蛋白水平（±s）比較

表1 不同組織S100A6 mRNA及其蛋白水平（±s）比較

例數(shù) mRNA水平 蛋白表達(dá)量癌旁組織 40 0.92±0.33 0.56±0.16肝組織 40 1.12±0.46 0.85±0.46癌組織 40 1.93±0.57 1.63±0.51

2.2 膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6水平及其與實(shí)驗室檢測指標(biāo)的相關(guān)性 40例膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6水平為（2456.85±128.31）pg/ml，顯著高于對照組的（2234.26±116.35）pg/ml（P＜0.05）；血清S100A6與CEA或CRP呈正相關(guān)（P＜0.05），與其它指標(biāo)無相關(guān)性（P＞0.05，表 2）。

表2 膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6與實(shí)驗室檢測指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6水平與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性 膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6水平與性別、年齡無相關(guān)性（P＞0.05），與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化程度呈正相關(guān)（P＜0.05，表 3）。

表3 膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6水平與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性

2.4 影響膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6高水平的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤浸潤深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和腫瘤細(xì)胞分化差是膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6高水平的危險性因素（P＜0.05，表 4）。

表4 影響膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6高水平的多因素Logistic回歸分析

3 討論

S100A6又稱為鈣周期蛋白，是S100蛋白家族中核心成員之一。該蛋白具有兩個EF手型結(jié)構(gòu)(螺旋-環(huán)-螺旋鈣結(jié)合域)，其羧基端與鈣離子具有較高的親和性。當(dāng)與鈣離子結(jié)合后，EF手型經(jīng)典區(qū)暴露，進(jìn)而與相應(yīng)的靶蛋白作用，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。它在腫瘤中的異常表達(dá)可通過各種基因調(diào)控及信號通路途徑對胃癌、胰腺癌、肝癌、膽管癌、結(jié)腸癌等腫瘤的生長、增殖、入侵和轉(zhuǎn)移起重要作用。該蛋白有可能成為臨床上新的腫瘤診斷分子標(biāo)志物[9-11]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于S100A6與膽管細(xì)胞癌相互作用以及對膽管細(xì)胞癌患者術(shù)后預(yù)后影響的研究相對較少。Kim et al研究團(tuán)隊通過微分斑點(diǎn)雜交和Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，S100A6在肝內(nèi)腫瘤組織表達(dá)上調(diào)。相比于肝細(xì)胞癌，膽管細(xì)胞癌S100A6 mRNA水平顯著增加，且免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)77.8%膽管癌組織染色陽性，10%原發(fā)性肝癌陽性，研究結(jié)果提示S100A6或許可用來區(qū)分膽管細(xì)胞癌與肝細(xì)胞癌[12]。Sato團(tuán)隊為研究S100A6蛋白在膽管癌組織表達(dá)的臨床和病理學(xué)意義，進(jìn)行了較為深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽管癌形成可誘導(dǎo)S100A6蛋白的表達(dá)，且S100A4、S100A6、S100P在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)與臨床病理因素 (淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期)無相關(guān)[13]。有研究用提取自魚藤芏的橙桑黃酮治療膽管癌并對癌細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A6蛋白表達(dá)上調(diào)，提示S100A6可能對膽管細(xì)胞癌細(xì)胞具有抑制作用[14]。本研究結(jié)果顯示，癌旁組織、肝組織、膽管細(xì)胞癌組織S100A6蛋白陽性表達(dá)率分別為20%、30%、65%，三者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。膽管細(xì)胞癌組織S100A6 mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于癌旁組織或肝組織，或許提示血清S100A6高水平有助于膽管細(xì)胞癌的診斷。膽管細(xì)胞癌患者血清S100A6水平顯著高于對照組。

除了膽管細(xì)胞癌，S100A6與胃癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等也密切相關(guān)。之前有報道指出，通過shRNA表達(dá)載體途徑可在食管癌Eca109細(xì)胞有效沉默S100A6基因，并進(jìn)一步抑制該細(xì)胞的增殖活性及遷移能力[7]。也有研究表明，膀胱癌、汗腺腫瘤和子宮內(nèi)膜異位癥患者血清S100A6呈高水平。Duan研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌，S100A6可通過影響MAPK通路促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移[8]。在肝細(xì)胞癌中也存在著S100A6基因的過度表達(dá)，并且推斷其通過PI3K/Akt信號通路及與β-鈣黏素有關(guān)的機(jī)制對肝癌發(fā)生發(fā)展起重要作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者血清S100A6水平與與CEA、CRP、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化程度呈正相關(guān)，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度是腫瘤患者血清S100A6高水平的危險因素。基于上述研究和先前的文獻(xiàn)報道，我們推斷S100A6或許可通過β-catenin蛋白、PI3K/Akt信號通路或MAPK信號通路上調(diào)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵犯性表型和惡性行為，并嚴(yán)重影響膽管癌患者術(shù)后的預(yù)后。本研究與馬亮等人的研究結(jié)論類似，他們證實(shí)S100A6蛋白表達(dá)與胃癌的腫瘤大小、浸潤深度、淋巴管和靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期等呈正相關(guān)，高中度S100A6基因表達(dá)的患者累積生存率明顯低于不表達(dá)的患者，并指出腫瘤的浸潤深度、淋巴管及靜脈浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及S100A6高表達(dá)均為胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素[16]。有研究指出，S100A6與膽管癌患者各實(shí)驗室指標(biāo)無相關(guān)性，但與臨床病理學(xué)參數(shù)有較高的相關(guān)性，同樣指出血清S100A6水平高不利于膽管癌患者術(shù)后生存[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)膽管癌患者肝組織和血清S100A6水平高，其意義還有待于進(jìn)一步研究。