花生醬中黃曲霉毒素B1的免疫傳感分析方法

畢春元，張金玲，杜祎，高廣恒，朱思榮

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250103）

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌屬的黃曲霉、特曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物，主要存在于霉變的花生、谷物、堅(jiān)果中，天然污染產(chǎn)生的黃曲霉毒素以AFB1最為多見。AFB1因具有極強(qiáng)的毒性和致癌性，在極低的濃度下即可對人和動物造成巨大傷害，故研究食品中黃曲霉毒素的檢測方法具有重要意義［1－5］。

目前黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有薄層層析法、免疫親和柱熒光光度法、高效液相色譜法及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等［6－10］。上述方法均需要操作人員與黃曲霉毒素頻繁接觸且每一步操作時間都有具體的要求，時間過短或者超時都會對結(jié)果產(chǎn)生很大影響。本文將研究采用免疫傳感器分析法來測定花生醬中黃曲霉毒素B1的含量，繁冗的數(shù)學(xué)計(jì)算由該儀器自動完成，測定結(jié)束直接讀取測定結(jié)果，且該儀器可減少計(jì)時因素對結(jié)果的影響，提高測定的準(zhǔn)確率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，美國Sigma公司；其他試劑：均為分析純；樣品：某品牌花生醬，濟(jì)南市環(huán)山路銀座購物超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平、Waters e 2695高效液相色譜儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；CF－630B粉碎機(jī) 廣州晨雕機(jī)械設(shè)備有限公司；旋渦振蕩器 北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司；超聲波儀 昆山超聲儀器有限公司；Meditronic BL－S型微處理器控制離心機(jī) 北京金恒祥儀器有限公司；HH－4/HH－（S）4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市友聯(lián)儀器研究所；Afla Star TMR免疫親和柱 美國Romers公司；黃曲霉毒素自動檢測儀 山東省科學(xué)院生物研究所自行研制。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器測定程序

黃曲霉毒素自動檢測儀的所有測定操作均由主程序控制實(shí)現(xiàn)，通過置位各個標(biāo)志位，通知主程序流程實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的操作。如在定時中斷中判斷是否過了1s，過了則置位過1s標(biāo)志。在主程序流程中檢測到過了1s，則發(fā)至彩屏中讀出時鐘指令。在串口中斷中接收到當(dāng)前時鐘，置位更新顯示時鐘標(biāo)志，在主程序中根據(jù)該標(biāo)志刷新時鐘顯示。同理在串口中斷中檢測到有觸屏操作，則置位有觸屏輸入標(biāo)志，在主控制流程中檢測到標(biāo)志位置，則處理觸屏操作。黃曲霉毒素自動檢測儀主程序控制流程圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素自動檢測儀主程序控制流程圖Fig.1Main program control flow chart of aflatoxin automatic detector

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

配制70%甲醛水溶液：精確稱取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品2.5，7.5，22.5，67.5，202.5mg分別倒入10mL燒杯中用70%甲醛水溶液溶解，再轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用70%甲醛水溶液定容，稀釋106倍，配成濃度為0.025，0.075，0.225，0.675，2.025ng/mL的黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 待測樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取20.0g花生醬樣品于250mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醛水溶液100mL，將瓶塞蓋緊，水封，震蕩10min，超聲波萃取15min，2000r/min離心5min，取20mL上清液備用。

2.4 測定方法

準(zhǔn)備好所需試劑，開始測定。

打開黃曲霉毒素B1免疫傳感分析儀，儀器自檢。自檢完成后通過觸摸儀器液晶屏進(jìn)入測定模式，按照提示依次放入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)行測定。測定結(jié)束后儀器自動對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將計(jì)算所得結(jié)果顯示在液晶屏上。

2.5 線性實(shí)驗(yàn)

分別參照2.1的方法配制濃度為20，40，60，80，100μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，用黃曲霉毒素B1免疫傳感分析儀進(jìn)行測定，選濃度作為X值，測定值作為Y值進(jìn)行回歸分析，經(jīng)計(jì)算得線性回歸方程：Y＝0.9948X，R2＝0.9999，其中 X為濃度，Y為測定值，R為相關(guān)系數(shù)，見圖2。

圖2 黃曲霉毒素B1線性范圍示意圖Fig.2Schematic diagram of the linear range of aflatoxin B1

由圖2可知，免疫傳感分析法在1.0～100μg/L范圍內(nèi)的線性良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

按照2.3的方法對50μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行10次測定，將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中：x＝50.1μg/L，RSD＝1.0%，n＝10，見表1。

表1 黃曲霉毒素B1精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1Results of aflatoxin B1precision test

2.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

參照2.3的方法配制黃曲霉毒素B1樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，將每個樣品中等體積加入濃度為20，40，60，80，100μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定黃曲霉毒素B1的含量。將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得加標(biāo)回收率為93%～104%，見表2。

表2 黃曲霉毒素B1加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2The experimental results of aflatoxin B1 with standard recoveries

2.8 對某品牌花生醬中黃曲霉毒素B1含量的測定

取某品牌花生醬參照2.3的方法處理，測定結(jié)果見表3。

表3 對某品牌花生醬中黃曲霉毒素B1含量的測定Table 3Determination of the content of aflatoxin B1 in some brand of peanut butter μg/L

2.9 用高效液相色譜法測定某品牌花生醬中黃曲霉毒素B1的含量

測定條件：色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：25℃；流動相：甲醇－乙腈－水（36∶12∶52）；流速：0.8mL/min；激發(fā)波長：365nm，發(fā)射波長：450nm；進(jìn)樣量：20μL。衍生溶液流速：0.3mL/min，衍生溫度：70℃。測定結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜Fig.3Determination of aflatoxin B1standard by HPLC

圖4 高效液相色譜法測定某品牌花生醬中黃曲霉毒素B1的圖譜Fig.4Determination of aflatoxin B1in some brand of peanut butter by HPLC

3 結(jié)語

本文采用黃曲霉毒素自動檢測儀測定花生醬中黃曲霉毒素B1的含量，提供了一種花生醬中黃曲霉毒素B1的免疫傳感分析方法。該方法操作簡單，自動化程度高，避免了操作人員與強(qiáng)毒性黃曲霉毒素的頻繁接觸，環(huán)境污染小，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，適用于花生醬中黃曲霉毒素B1的檢測。