響應(yīng)面法優(yōu)化酸甘藍(lán)發(fā)酵條件

董靜，姚妙愛

（江蘇財經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

酸甘藍(lán)作為一種傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜腌制品，其酸香味鮮，口感脆爽，不僅可以直接食用，還可用于制作美味的漬菜粉、酸菜湯。具有開胃除膩，增進(jìn)食欲，幫助消化的功效，能夠促進(jìn)人體對鐵等礦質(zhì)元素的吸收，并且其發(fā)酵和生產(chǎn)過程簡單，人們對此都津津樂道［1，2］。酸甘藍(lán)主要是通過乳酸發(fā)酵而成，不僅保留了VC、氨基酸、有機(jī)酸以及膳食纖維等原料原有的營養(yǎng)成分，還含有乳酸菌等功能性微生物［3］，隨著人們進(jìn)一步揭示了乳酸菌對人體健康有益作用的機(jī)理，酸菜生產(chǎn)與加工引起了國內(nèi)外的高度重視。

隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，酸甘藍(lán)工藝有了不同程度的改變，對發(fā)酵劑、食鹽濃度進(jìn)行了大量的研究，Elena Peas等研究發(fā)現(xiàn)酸甘藍(lán)質(zhì)量好和生物胺含量最低的最佳發(fā)酵條件是腸膜明串珠菌和0.5%食鹽濃度［4］。韓國玲等提出發(fā)酵劑5%乳酸菌純培養(yǎng)物［5］，發(fā)酵溫度20～25℃，發(fā)酵時間20天條件下發(fā)酵的酸白菜在感官指標(biāo)上有明顯改善；祝戰(zhàn)斌等認(rèn)為采用鹵汁食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.25%［6］，白糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，發(fā)酵溫度為22℃，發(fā)酵接種量為1%的自然發(fā)酵結(jié)合人工接種發(fā)酵甘藍(lán)泡菜具備自然發(fā)酵風(fēng)味好、人工接種時間快的優(yōu)點(diǎn)。

由于酸甘藍(lán)發(fā)酵過程中會產(chǎn)生亞硝酸鹽，令許多消費(fèi)者望而生畏，我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，醬腌菜中亞硝酸鹽含量不得超過20mg/kg，降低酸甘藍(lán)中亞硝酸鹽的含量是其工業(yè)化生產(chǎn)必須要解決的問題。本研究以酸甘藍(lán)的感官指標(biāo)、營養(yǎng)指標(biāo)、安全指標(biāo)、生產(chǎn)周期等綜合評價為指標(biāo)值，研究了適宜于工業(yè)化實施的食鹽添加量、接種量、發(fā)酵溫度等發(fā)酵條件對酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的影響并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，這將對酸甘藍(lán)工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

結(jié)球甘藍(lán)（包菜）：購于淮安農(nóng)貿(mào)市場；

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）：遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物實驗室提供；

泡菜鹽：江蘇省鹽寶鹽業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑

碳酸氫鈉、抗壞血酸、乙酸鋅、冰醋酸、亞鐵氰化鉀、硼酸鈉、鹽酸、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、硝酸鈉、氨水、草酸、2，6－二氯靛酚、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉、檸檬酸二胺、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、磷酸氫二鉀、瓊脂（均為國藥分析純）。

MRS液體試管培養(yǎng)基：蛋白胨1.0g，葡萄糖5.0g，牛肉膏1.0g，酵母膏0.5g，乙酸鈉0.5g，硫酸錳0.025g，檸檬酸二胺0.2g，硫酸鎂0.02g，吐溫80 0.1g，磷酸氫二鉀0.2g，加蒸餾水至100mL，pH 6.2～6.4，121℃，15～20min滅菌［7］。

MRS固體試管培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加瓊脂2g。

1.2 儀器與設(shè)備

DZQ400－2D真空包裝機(jī) 昆山康佳包裝機(jī)械有限公司；SW－CJ－2F超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX－50FA滅菌鍋、LHS－150SC電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS－3C酸度計 上海世義精密儀器有限公司；FA1004電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；S22PC可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；HH－D4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實驗儀器廠；組織搗碎機(jī)：HR2095飛利浦?jǐn)嚢铏C(jī) 飛利浦（中國）投資有限公司；50L雙層內(nèi)蓋塑料桶 山東慶云普利塑料制品銷售中心。

1.3 方法

1.3.1 酸甘藍(lán)加工工藝

1.3.1.1 酸甘藍(lán)加工工藝流程

1.3.1.2 發(fā)酵劑的制備

固體試管菌種活化：將本實驗室篩選后保存在冰箱中的固體菌種穿刺接種到固體MRS試管培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)24h，得活化菌種。

液體試管菌種制備：將培養(yǎng)好的固體試管中的菌種接種到盛有5mL液體MRS培養(yǎng)基的20mm×200mm試管中，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24h。

液體培養(yǎng)瓶菌種制備：將培養(yǎng)好的液體試管中的菌種按2%（V/V）接種到盛有1L液體MRS培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24h。

種子罐菌種制備：甘藍(lán)經(jīng)整理、清洗，縱向切開，裝滿5L泡菜壇，按2%接入培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)瓶中菌種，加入1%（W/V罐）食鹽水溶液灌滿，于30℃培養(yǎng)，發(fā)酵期間保持菜在發(fā)酵水以下，直至發(fā)酵水pH達(dá)到3.5。

1.3.1.3 加工操作要點(diǎn)

甘藍(lán)挑選、修整、清洗：挑選新鮮、成熟、無病蟲害的甘藍(lán)，除去外葉、老葉，挖掉根芯，清洗干凈。

裝罐、發(fā)酵：將清洗干凈的甘藍(lán)裝滿50L發(fā)酵桶，1層菜1層鹽，接入種子罐菌種，菌種分3次添加，裝滿后用木板壓蓋，加入自來水將發(fā)酵桶灌滿，菜在液面以下，在發(fā)酵液表面蓋上塑料薄膜，保持厭氧發(fā)酵。

切絲：將發(fā)酵好的甘藍(lán)放入切菜機(jī)將酸甘藍(lán)切成1.5～2mm寬的細(xì)絲［8］。

包裝：將發(fā)酵好的甘藍(lán)絲去除多余的水分，以每袋300g進(jìn)行真空塑料包裝。

1.3.2 酸甘藍(lán)發(fā)酵終點(diǎn)判斷

酸甘藍(lán)pH值達(dá)到3.5以下，每袋裝入酸甘藍(lán)300g真空包裝，置于30℃下培養(yǎng)2天不脹袋。

1.3.3 酸甘藍(lán)感官品質(zhì)評定方法

由10人組成品評小組，按照評分標(biāo)準(zhǔn)表，通過感官評價酸甘藍(lán)產(chǎn)品的色澤、香氣、質(zhì)地和滋味，并做好記錄，以感官綜合評分判定產(chǎn)品的感官品質(zhì)［9］，色澤滿分25、香氣滿分25、滋味滿分25、質(zhì)地滿分25，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 酸甘藍(lán)感官品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1Criteria for sensory evaluation of sauerkraut

1.3.4 酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)統(tǒng)計方法

綜合品質(zhì)的統(tǒng)計分析采用模糊綜合評判法［10］，以感官評分（u1）、亞硝酸鹽含量（u2）、酸度pH（u3）、維生素C含量（u4）、發(fā)酵時間（u5）作為評價因素，評價因素U＝｛u1，u2，u3，u4，u5｝建立評價因素隸屬函數(shù)，以各因素在不同處理間的最大值為基準(zhǔn)，即max＝｛ui1，ui2，ui3，ui4，ui5｝＝uib，通過隸屬函數(shù)得出U的模糊矩陣因素值具有均一可比性。權(quán)重系數(shù)根據(jù)各因素的重要性來給定，本文的權(quán)重系數(shù)中感官品質(zhì)0.4，亞硝酸鹽含量0.2，pH 值0.1，維生素C含量0.2，發(fā)酵時間0.1，所有權(quán)數(shù)之和為1。權(quán)重系數(shù)矩陣 M＝（0.4，0.2，0.1，0.2，0.1），評價結(jié)果為V＝MR，根據(jù)V的大小來判斷綜合品質(zhì)的相應(yīng)優(yōu)劣。其中亞硝酸鹽含量的數(shù)值越小，對人體的危害越小，綜合品質(zhì)越高；pH值越低說明酸甘藍(lán)酸味越濃，綜合品質(zhì)越高；發(fā)酵時間越短，生產(chǎn)效率越高，綜合品質(zhì)越高。因此，為了品質(zhì)優(yōu)劣的一致性，將亞硝酸鹽含量、pH值、發(fā)酵時間的數(shù)值顛倒，亞硝酸鹽含量、pH值、發(fā)酵時間的隸屬函數(shù)為

1.3.5 單因素試驗

在發(fā)酵罐中按照1%（W 鹽∶V罐）食鹽、2%（V菌種∶V罐）接種，30℃發(fā)酵，直至發(fā)酵結(jié)束，評定酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)，測定酸甘藍(lán)中維生素C、亞硝酸鹽含量，測定pH值，記錄發(fā)酵時間。分別考察食鹽添加量 （0，0.5%，1%，2%，3%）、接種量（0，0.5%，1%，2%，5%，10%）、發(fā)酵溫度（10，15，20，25，30 ℃）對酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的影響，平行3次試驗，取平均值。

1.3.6 響應(yīng)面分析法

確定影響酸甘藍(lán)發(fā)酵的關(guān)鍵因素后，用Design Expert軟件（Vision 7.1.3，Stat－Ease.Inc.，Minneapolis，MN.USA）設(shè)計試驗，采用Box－Behnken法，以確定最優(yōu)發(fā)酵條件。本文在單因素試驗基礎(chǔ)上，以食鹽添加量、接種量、發(fā)酵溫度3個因素為自變量，以酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)評價V值為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平試驗，共計17個試驗點(diǎn)，通過試驗數(shù)據(jù)的二次回歸擬合分析得到各因素與響應(yīng)值間的回歸方程，分析各因素與響應(yīng)值間的主效應(yīng)、因素間的交互效應(yīng)得到最佳響應(yīng)值，最終確定酸甘藍(lán)發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件，因素水平選取見表2。

表2 響應(yīng)面因素與水平Table 2Factors and levels of response surface

1.3.7 檢測方法

維生素C含量的測定：采用GB/T 6195－1986的2，6－二氯靛酚滴定法。

亞硝酸鹽含量的測定：采用 GB 5009.33－2010的鹽酸萘乙二胺法。

pH值的測定：采用pH計法，將酸甘藍(lán)榨汁，使用精密pH計測定汁液的pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 食鹽添加量對酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的影響

在其他因素相同的條件下，加鹽量不同可以控制微生物生長及它們在食品發(fā)酵過程中的活動［11］；適宜的食鹽濃度不僅可以抑制有害菌的生長，增加保質(zhì)期，具有防腐作用，還可以增加食品的獨(dú)特風(fēng)味。甘藍(lán)在腌制時分別加入不同量的食鹽，最終產(chǎn)品的感官評分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量及綜合品質(zhì)見表3。

表3 不同食鹽添加量下酸甘藍(lán)各品質(zhì)指標(biāo)測定值及綜合品質(zhì)Table 3Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different salt content

由表3可知，食鹽的添加量為0.5%時，酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)評分最高，Vc保存最好；食鹽的添加量為1%時，酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)評分較高，亞硝酸鹽含量最低，酸度最低，發(fā)酵時間最短。食鹽的添加量在1%時，酸甘藍(lán)的綜合評價值為0.725，綜合品質(zhì)最好。因此，選用食鹽添加量1%作為較優(yōu)添加量。

2.2 接種量對酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的影響

在發(fā)酵開始時接入大量的乳酸菌，可以迅速地生長繁殖，并且抑制雜菌的生長，促使乳酸發(fā)酵的進(jìn)行［12］，適宜的接種量，可促使乳酸菌快速地繁殖，促進(jìn)酸甘藍(lán)風(fēng)味形成。甘藍(lán)在腌制時分別接入不同的接種量，最終產(chǎn)品的感官評分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量及綜合品質(zhì)見表4。

表4 不同接種量下酸甘藍(lán)各品質(zhì)指標(biāo)測定值及綜合品質(zhì)Table 4Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different inoculum size

由表4可知，當(dāng)接種量為2%，5%時產(chǎn)品感官品質(zhì)評分高，亞硝酸鹽含量低，pH較低，VC保存較好，發(fā)酵時間較短；當(dāng)接種量為10%時Vc含量最高，發(fā)酵時間最短。發(fā)酵劑接種量為5%時，酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)評估值為0.750，綜合品質(zhì)最好，這與韓國玲以感官質(zhì)量為指標(biāo)值，確定的最佳接種量一致。因此，選擇發(fā)酵劑5%作為較優(yōu)添加量。

2.3 發(fā)酵溫度對酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的影響

酸甘藍(lán)的發(fā)酵主要是以乳酸發(fā)酵為主，其中的乳酸菌屬于中溫微生物，發(fā)酵溫度影響甘藍(lán)發(fā)酵時間和產(chǎn)品的最終酸度，分別測定不同發(fā)酵溫度下酸甘藍(lán)的感官評分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量、發(fā)酵時間和綜合品質(zhì)，結(jié)果見表5。

表5 不同發(fā)酵溫度下酸甘藍(lán)的各品質(zhì)指標(biāo)值及綜合品質(zhì)Table 5Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different fermentation temperatures

由表5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，亞硝酸鹽含量降低，Vc保存率升高，發(fā)酵周期縮短，生產(chǎn)成本降低。在20℃下發(fā)酵，酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)最好，酸度最低；在30℃下發(fā)酵，亞硝酸鹽含量最低，VC含量最高，發(fā)酵時間最短。當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃時，酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)評估值為0.835，綜合品質(zhì)最佳。賈樹彪認(rèn)為在較低溫度下發(fā)酵效果較好，對發(fā)酵過程的起動與產(chǎn)品風(fēng)味的形成有重要的作用，但發(fā)酵溫度過低，發(fā)酵時間長，生產(chǎn)成本高，VC保存率低。發(fā)酵溫度過高，發(fā)酵過程中極易引起雜菌的生長，引起酸甘藍(lán)腐爛變質(zhì)、變色、變味，導(dǎo)致發(fā)酵管理困難。在不同的溫度下發(fā)酵甘藍(lán)，發(fā)酵結(jié)束時，酸甘藍(lán)中亞硝酸鹽的含量均遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)，食用安全。因此，選擇25℃作為較優(yōu)發(fā)酵溫度。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化酸甘藍(lán)發(fā)酵工藝

2.4.1 二次回歸擬合及方差分析

利用Design－Expert統(tǒng)計分析軟件對響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案與結(jié)果，見表6。

表6 Box－Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6Experimental design and results of Box－Behnken

利用 Design Expert 7.1.3軟件對表6試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，獲得酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)評價V對加鹽量、接種量以及發(fā)酵溫度的二次多項回歸方程：

V＝0.84－8.858E－003A ＋4.812E－004B＋0.071C＋0.026AB－3.534E－003AC＋0.018BC－0.072A2－0.048B2－0.15C2，對此回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

表7 方差分析表Table 7Results of regression analysis

由表7可知，該回歸模型P＜0.0001，表明該模型極顯著，能解釋酸甘藍(lán)綜合評價值的變化。各因素的一次項C為極顯著，二次項A2和B2為顯著，C2均為極顯著，交互項AB和BC為顯著，且失擬項不顯著，表明該模型與實際情況擬合很好，可用于預(yù)測酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)。線性方程的相關(guān)系數(shù)R2＝0.9881，校正系數(shù) R2＝0.9729，信噪比（Adeq Precision）＝22.077遠(yuǎn)大于4，表明該模型的準(zhǔn)確性、適用性較好，預(yù)測值與實際值擬合好，能夠很好用于酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)評價的分析和預(yù)測。由F值大小可知，影響酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的因素主次順序為C＞A＞B，即發(fā)酵溫度＞食鹽添加量＞接種量。

2.4.2 試驗結(jié)果分析與優(yōu)化

利用Design Expert軟件對表6中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖1～圖3。

圖1 食鹽添加量與接種量交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.1The response surface and contour of the interaction between salt content and inculum size

由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵溫度一定時，食鹽添加量與接種量兩個因素之間交互作用顯著，食鹽添加量在高水平時，酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的響應(yīng)拋物曲線的最高點(diǎn)也處在較低水平，而隨著食鹽添加量的下降，酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的響應(yīng)拋物曲線的最高點(diǎn)向高水平方向移動。當(dāng)接種量一定時，隨著食鹽添加量的增加，酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)先升高后降低，說明在低濃度食鹽時有利于接種乳酸發(fā)酵，鹽濃度過大增大反而抑制乳酸菌的生長。

圖2 食鹽添加量與發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.2The response surface and contour of the interaction between salt content and fermentation temperature

由圖2可知，當(dāng)接種量一定時，食鹽添加量與發(fā)酵溫度的交互作用不顯著。當(dāng)食鹽添加量一定時，發(fā)酵溫度在20～25℃，隨著發(fā)酵溫度的升高，酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)升高。發(fā)酵溫度在25～30℃，發(fā)酵溫度影響不顯著，隨著溫度的升高，酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)降低，因為此溫度范圍為乳酸菌的適宜溫度，發(fā)酵快、時間短；但溫度過高，也易引起腐敗細(xì)菌、霉菌等有害微生物的生長，菜色澤變暗，風(fēng)味變差。

圖3 接種量與發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.3The response surface and contour of the interaction between inculum size and fermentation temperature

由圖3可知，當(dāng)食鹽濃度一定時，接種量和發(fā)酵溫度交互作用顯著性較弱。酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)主要由發(fā)酵溫度決定，隨著發(fā)酵溫度的升高，酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)先增大后減小。低接種量下，適宜的發(fā)酵溫度對酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)有利，因為接種量小、適宜的溫度可以使乳酸菌快速地生長繁殖，并抑制其他雜菌的生長，促使乳酸發(fā)酵的進(jìn)行。

2.4.3 優(yōu)化結(jié)果與驗證試驗

將酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)取最大值，通過Design Expert 7.1.3軟件自動分析得到最優(yōu)條件：食鹽添加量1%、接種量5%、發(fā)酵溫度25℃，在此條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)V達(dá)到0.838。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對酸甘藍(lán)的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，建立的二次多項式數(shù)學(xué)模型顯著性良好。酸甘藍(lán)發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝條件為食鹽添加量1%，接種量5%，發(fā)酵溫度25℃。在此發(fā)酵條件下，酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)得分為88，含亞硝酸鹽0.02mg/kg、Vc 4.34mg/kg，pH為3.25，發(fā)酵時間23天。