乳酸鏈球菌素對(duì)腹瀉小鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)及脂代謝的影響

賀美玲　王純潔　賈知鋒　斯木吉德　吉米斯　劉　波　陳　浩　超　克　敖日格樂(lè)*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)

通過(guò)攝入益生菌可平衡動(dòng)物腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，通過(guò)研究益生菌的代謝產(chǎn)物[如乳酸鏈球菌素(Nisin)]對(duì)腸道微生物多樣性和脂代謝的影響[1]，可以幫助人們深入了解益生菌的代謝產(chǎn)物對(duì)腸道菌群和肥胖癥的影響。肥胖癥是由能量攝入和代謝不平衡所引起的一種慢性疾病，其一直影響著動(dòng)物的胴體品質(zhì)[2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與肥胖存在密切的相關(guān)性，而脂代謝的紊亂嚴(yán)重影響了腸道菌群的結(jié)構(gòu)[3]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群落對(duì)于處理膳食多糖是必不可少的，并發(fā)現(xiàn)與無(wú)菌飼養(yǎng)相比，正常飼養(yǎng)使小鼠體內(nèi)脂肪量增加60%，胰島素含量減少[4]。金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白1(ADAMTS1)是調(diào)控脂肪干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的關(guān)鍵因子。高脂飲食以及糖皮質(zhì)激素類藥物會(huì)下調(diào)ADAMTS1的分泌，最終導(dǎo)致脂肪的增加[5]。乳酸乳球菌可用于治療炎癥性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、腹瀉、乳糜瀉、變態(tài)反應(yīng)和口腔黏膜炎等[6-7]。致病性大腸桿菌(E.coli)可引起多種疾病的發(fā)生，如腹瀉及敗血癥等[8]。致病性E.coliO1是犢牛腹瀉病最常見(jiàn)的病原菌之一[9]。目前，抗生素廣泛應(yīng)用于治療人類及家畜腹瀉病，而抗生素的濫用使細(xì)菌耐藥性增加[10-11]。據(jù)研究，Nisin在治療小鼠腹瀉方面有望替代抗生素，Nisin對(duì)家畜脂代謝十分重要[12]。本試驗(yàn)通過(guò)致病性E.coliO1構(gòu)建小鼠腹瀉模型，然后對(duì)腹瀉小鼠灌胃Nisin，研究Nisin對(duì)腹瀉小鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)以及血清、空腸、回腸與腦組織中ADAMTS1、總膽固醇(TC)和胰島素(INS)含量的影響，以期為研究Nisin這類益生菌代謝產(chǎn)物對(duì)腸道菌群和脂代謝的影響奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

受試菌：牛源致病性E.coliO1和Nisin均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)學(xué)實(shí)驗(yàn)室從奶牛直腸糞樣中分離提取純化[13]。

抗生素：氨芐青霉素(ampicillin)購(gòu)自葵花藥業(yè)集團(tuán)湖北武當(dāng)有限公司；鹽酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)購(gòu)自吉林省百年六福堂藥業(yè)有限公司。

1.2　試驗(yàn)動(dòng)物

7～9周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)小鼠，雌雄各占1/2，體重(20±2) g，購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠飼養(yǎng)在恒定溫度[(22±2) ℃]和濕度[(55±5)%]的環(huán)境中，飼喂SPF級(jí)飼料[14]。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1試驗(yàn)分組及給藥方案

選擇7～9周齡SPF級(jí)50只小鼠(雌雄各占1/2)，隨機(jī)分成5組，分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、環(huán)丙沙星組、氨芐青霉素組及Nisin組。除空白對(duì)照組腹腔注射滅菌生理鹽水(0.2 mL/只)外，其余各組小鼠均連續(xù)3 d腹腔注射致病性E.coliO1懸液(2.50×1011CFU/mL)0.2 mL/只構(gòu)建小鼠腹瀉模型[15]。連續(xù)注射3 d后，各組小鼠灌服對(duì)應(yīng)試驗(yàn)藥品(給藥方案見(jiàn)表1)，連續(xù)灌服15 d，2次/d(08:00、16:00)，每次0.3 mL，在第15天灌胃2 h后對(duì)小鼠進(jìn)行樣品采集。

表1　試驗(yàn)分組情況及給藥方案

每只動(dòng)物單次所用藥量需用0.3 mL蒸餾水配合灌服。

The dose of each animal used a single dose of 0.3 mL of distilled water in conjunction with gavage.

1.3.2樣品采集

在試驗(yàn)期間每天稱小鼠體重，在第15天灌胃2 h后，每組取7只小鼠，脫臼處死，通過(guò)眼眶采血，分離血清并保存；在無(wú)菌操作臺(tái)中對(duì)每只小鼠進(jìn)行消毒處理后，打開(kāi)小鼠腹腔分別稱取0.5 g盲腸內(nèi)容物以及空腸、回腸和腦組織并迅速置于無(wú)菌無(wú)酶的2.5 mL離心管中，然后放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3指標(biāo)測(cè)定

將空腸、回腸與腦組織進(jìn)行研磨后，分別稱取0.1 g各加900 μL的磷酸鹽緩沖液(PBS)，制備成組織勻漿液，混勻并離心保留上清液，放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。?duì)血清、空腸、回腸及腦組織采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)ADAMTS1、TC和INS的含量，按照說(shuō)明書(shū)操作，試劑盒均購(gòu)自北京誠(chéng)林生物科技有限公司。

將裝有盲腸內(nèi)容物的離心管放入干冰中送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司，對(duì)細(xì)菌341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)、805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)16r RNA V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。詳細(xì)步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[17]。利用barcode區(qū)分樣品序列，將各組樣本序列過(guò)濾后，進(jìn)行Alpha多樣性及菌群結(jié)構(gòu)分析，Alpha多樣性指數(shù)包括豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù))、多樣性指數(shù)(Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù))、覆蓋率(Coverage指數(shù))。利用Mothur軟件對(duì)每組樣品的操作分類單元(OTU)進(jìn)行聚類分析，其代表了組間樣品的豐度[18]。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel 2016處理數(shù)據(jù)，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1　Nisin對(duì)小鼠體重的影響

由表2可知，1～5 d階段，Nisin組小鼠的體重顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。在6～10 d階段，Nisin組小鼠的體重顯著高于其他各組(P<0.05)，其他各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。在11～15 d階段，Nisin組小鼠的體重顯著高于陰性對(duì)照組、環(huán)丙沙星組及氨芐青霉素組(P<0.05)，與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明Nisin能有效緩解感染E.coliO1對(duì)小鼠體重的影響。

表2　Nisin對(duì)小鼠不同階段體重的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same row with different lower case letter superscripts are significantly different (P<0.05). The same as below.

2.2　Nisin對(duì)小鼠血清、空腸、回腸與腦組織中ADAMTS1含量的影響

由表3可知，在血清中，Nisin組小鼠ADAMTS1的含量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)；在空腸中，Nisin組小鼠ADAMTS1的含量顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，顯著高于環(huán)丙沙星組和氨芐青霉素組(P<0.05)；在回腸中，Nisin組小鼠ADAMTS1的含量顯著低于其他各組(P<0.05)；在腦組織中，Nisin組小鼠ADAMTS1的含量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，顯著高于環(huán)丙沙星組(P<0.05)。

表3　Nisin對(duì)小鼠血清、空腸、回腸與腦組織中ADAMTS1含量的影響

2.3　Nisin對(duì)小鼠血清、空腸、回腸與腦組織中TC含量的影響

由表4可知，在血清中，Nisin組TC的含量高于陰性對(duì)照組、環(huán)丙沙星組和氨芐青霉素組，低于空白對(duì)照組，但差異均未達(dá)顯著水平(P>0.05)；在空腸中，Nisin組TC的含量與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)；在回腸中，Nisin組TC的含量顯著高于環(huán)丙沙星組(P<0.05)；在腦組織中，Nisin組TC的含量顯著低于氨芐青霉素組(P<0.05)，顯著高于其他各組(P<0.05)。

表4　Nisin對(duì)小鼠血清、空腸、回腸與腦組織中TC含量的影響

2.4　Nisin對(duì)小鼠血清、空腸、回腸與腦組織中INS含量的影響

由表5可知，在血清中，Nisin組和空白對(duì)照組INS的含量顯著高于其他各組(P<0.05)，且以Nisin組的含量最高；在空腸中，氨芐青霉素組INS的含量顯著低于其他各組(P<0.05)，陰性對(duì)照組INS的含量顯著高于其他各組(P<0.05)；在回腸中，空白對(duì)照組INS的含量顯著高于其他各組(P<0.05)，Nisin組INS的含量顯著低于其他各組(P<0.05)；在腦組織中，空白對(duì)照組中INS的含量顯著高于其他各組(P<0.05)，環(huán)丙沙星組的INS含量顯著低于其他各組(P<0.05)。

表5　Nisin對(duì)小鼠血清、空腸、回腸與腦組織中INS含量的影響

2.5　Nisin對(duì)小鼠盲腸菌群多樣性的影響

由表6可知，在各組盲腸內(nèi)容物樣品中，菌群OTU數(shù)量最多的是空白對(duì)照組(1 652.75)，其次是Nisin組(1 507.75)，最小是氨芐青霉素組(930.0)，說(shuō)明Nisin組和空白對(duì)照組盲腸中菌群豐度很高，并且各組間存在差異。在盲腸內(nèi)容物樣品中，Nisin組的菌群Alpha多樣性指數(shù)中的ACE指數(shù)(1 417.25)、Chao1指數(shù)(1 378.45)和Shannon指數(shù)(7.56)均顯著高于陰性對(duì)照組(ACE指數(shù)為969.54，Chao1指數(shù)為340.29，Shannon指數(shù)為6.63)(P<0.05)，Simpson指數(shù)(0.003 3)顯著低于陰性對(duì)照組(0.017 4)(P<0.05)。這表明Nisin組小鼠中盲腸菌群多樣性高于陰性對(duì)照組。Nisin組Shannon指數(shù)在5個(gè)組中最大，Simpson指數(shù)在5個(gè)組中處在較低水平，說(shuō)明Nisin組小鼠盲腸菌群多樣性在5個(gè)組中處在較高水平。各組盲腸內(nèi)容物菌群的Coverage指數(shù)均在9.7以上，因此，樣品測(cè)序質(zhì)量較高，未被檢測(cè)到的可能性極低。

利用Mothur軟件對(duì)各組樣品進(jìn)行注釋。通過(guò)對(duì)各組間小鼠盲腸內(nèi)容物的16S rRNA V3～V4區(qū)測(cè)序，根據(jù)物種注釋結(jié)果，各組在門水平上的物種相對(duì)豐度見(jiàn)圖1。Nisin組中疣微菌門(Verrucomicrobia)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)及厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢(shì)菌門。陰性對(duì)照組中放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、變形菌門(Proteobacteria)及擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。環(huán)丙沙星組中厚壁菌門、放線菌門、纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)(未定門)及Coriobacteriia(未定門)為優(yōu)勢(shì)菌門。氨芐青霉素組中脫鐵桿菌門(Deferribacteres)及厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門?？瞻讓?duì)照組中擬桿菌門、厚壁菌門及Saccharibacteria為優(yōu)勢(shì)菌門。

表6　各組小鼠盲腸內(nèi)容物中菌群OTU數(shù)量及Alpha多樣性指數(shù)

AMPG：氨芐青霉素組 ampicillin group；BCG：空白對(duì)照組 blank control group；CIPG：鹽酸環(huán)丙沙星組 ciprofloxacin group；NCG：陰性對(duì)照組 negative control group；NIG：Nisin組 Nisin group；Phylum：門。

圖1各組物種相對(duì)豐度聚類圖

Fig.1Cluster of relative abundances of species in groups

2.6　Nisin對(duì)小鼠盲腸菌群構(gòu)成的影響

5組盲腸內(nèi)容物樣品中在門水平上排名靠前的4種菌群所占比例見(jiàn)表7。Nisin組中厚壁菌門所占比例顯著高于其他各組(P<0.05)，擬桿菌門所占比例顯著低于其他各組(P<0.05)。這說(shuō)明Nisin有利于增加小鼠盲腸中厚壁桿菌門的數(shù)量，降低擬桿菌門的數(shù)量。

表7　在門水平上各組小鼠盲腸內(nèi)容物中菌群構(gòu)成

3　討　論

動(dòng)物腸道內(nèi)生存著大量的細(xì)菌，一旦腸道生物屏障中的微生態(tài)系統(tǒng)失衡，就會(huì)導(dǎo)致大量致病菌(如大腸桿菌等)入侵和定植[19]。此外，腸道也是動(dòng)物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所，攝入過(guò)多的食物后體內(nèi)脂肪開(kāi)始堆積[20]。腸道菌群在調(diào)節(jié)能量代謝過(guò)程中起到非常重要的作用，調(diào)整菌群的失衡可使體重、血清TP含量和空腹血糖水平顯著下降[21]。給無(wú)菌小鼠定植腸道菌群后，其消耗高脂高糖食物的量顯著增加，由此說(shuō)明腸道菌群可顯著增強(qiáng)小鼠的消化能力，從而使小鼠獲取食物能量的能力加強(qiáng)[22]。腸道內(nèi)致病菌和益生菌(如雙歧桿菌、乳酸桿菌等)數(shù)量的變化是腸道健康的重要指標(biāo)[23]。Yassour等[24]認(rèn)為，抗生素對(duì)腸道菌群的影響機(jī)制還未清晰，但抗生素可顯著影響人類及動(dòng)物腸道菌群的多樣性。同時(shí)，人類及動(dòng)物腸道中存在著的大量細(xì)菌可幫助分解難以消化的食物。把正常小鼠的腸道菌群移植給無(wú)菌小鼠，在攝食量未增加的情況下，無(wú)菌小鼠的體脂含量顯著增加，同時(shí)一些與脂代謝相關(guān)的因子的含量也發(fā)生了改變，這些改變也許是因?yàn)槟c道菌群影響宿主對(duì)食物中能量的吸收所致[25]。ADAMTS1控制脂肪分化和監(jiān)管脂肪平衡的關(guān)鍵分子[5]。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的脂肪細(xì)胞會(huì)正常分泌ADAMTS1[26-27]。目前，對(duì)小鼠肥胖癥的研究主要是通過(guò)檢測(cè)小鼠血液中相關(guān)因子的信號(hào)通路和相關(guān)蛋白的表達(dá)量以及通過(guò)高通量檢測(cè)腸道菌群的結(jié)構(gòu)譜來(lái)進(jìn)行的[28]。具有高的ADAMTS1含量的小鼠，它們體內(nèi)的脂肪存儲(chǔ)量比野生小鼠的脂肪存儲(chǔ)要小[29-30]。ADAMTS1能夠阻止糖皮質(zhì)誘導(dǎo)的脂肪分化[31]。研究表明，通過(guò)降低脂肪組織中ADAMTS1的含量可導(dǎo)致小鼠脂肪組織重量增加、INS敏感性下降及脂代謝紊亂，這一發(fā)現(xiàn)與ADAMTS1在肥胖小鼠中的表達(dá)下調(diào)及ADAMTS1的表達(dá)量與人體的身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果相一致[32]。肥胖常導(dǎo)致脂代謝紊亂，其機(jī)制是由于內(nèi)臟脂肪堆積，促進(jìn)糖異生，高含量的INS使食欲增加，加重膽固醇代謝紊亂，促進(jìn)肥胖加重[33]。研究發(fā)現(xiàn)，食用含乳酸球菌食物后，人體血液中高密度脂蛋白的含量顯著升高[34]，但是食用含乳酸桿菌食物后，人體血液中高密度脂蛋白的含量顯著降低[35]。在飼糧中添加微生物菌種可提高豬的生產(chǎn)性能和自身免疫力，在改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝等方面效果顯著[36]。乳酸發(fā)酵的乳酸乳球菌最近被評(píng)估為潛在的益生菌[37]。本試驗(yàn)中，益生菌的代謝產(chǎn)物Nisin能緩解小鼠體重的增加，降低小鼠血清中TC的含量，從而達(dá)到改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及脂代謝紊亂的效果，這說(shuō)明Nisin有降低患心腦血管病的危險(xiǎn)的作用[38-39]；同時(shí)，Nisin能降低回腸中INS的含量，對(duì)調(diào)節(jié)脂代謝合成具有重要意義，這一結(jié)果與Xu等[40]所得結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖與擬桿菌門及厚壁菌門相對(duì)豐度的改變存在關(guān)系，飲食治療前，肥胖者與苗條者比較，其腸道中擬桿菌門的數(shù)量非常少，但厚壁菌門數(shù)量較多，飲食治療后，肥胖者出現(xiàn)了腸道中擬桿菌門數(shù)量增加、厚壁菌門數(shù)量減少的現(xiàn)象[25]。

本研究中，與陰性對(duì)照組相比，Nisin可使小鼠血清、空腸、回腸和腦組織中ADAMTS1含量顯著降低，血清、空腸和腦組織中TC的含量增加，回腸中INS的含量降低，導(dǎo)致小鼠體重增加；Nisin使小鼠盲腸內(nèi)容物中厚壁菌門的數(shù)量增加，擬桿菌門的數(shù)量降低，說(shuō)明Nisin可調(diào)節(jié)小鼠盲腸菌群構(gòu)成；Nisin使小鼠盲腸內(nèi)容物菌群的ACE、Chao1、Shannon指數(shù)顯著增加，Simpson指數(shù)顯著降低，說(shuō)明Nisin可提高小鼠盲腸菌群多樣性。此外，陰性對(duì)照組小鼠盲腸內(nèi)容物菌群的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)最低較空白對(duì)照組顯著降低，Simpson指數(shù)較空白對(duì)照組顯著升高，說(shuō)明E.coliO1可破壞小鼠腸道微生物的動(dòng)態(tài)平衡，使小鼠盲腸菌群多樣性顯著降低，這一結(jié)果與李藝等[41]所得結(jié)果相似。

綜上所述，一方面，Nisin通過(guò)降低血清、空腸、回腸和腦組織中ADAMTS1的含量和回腸中INS的含量，增加血清、空腸和腦組織中TC的含量，使小鼠體重增加；另一方面，Nisin通過(guò)增加小鼠腸道內(nèi)容物中菌群的多樣性，增加厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門的數(shù)量，降低擬桿菌門的數(shù)量，調(diào)整盲腸菌群結(jié)構(gòu)?？梢?jiàn)，Nisin很可能是通過(guò)改變小鼠腸道固有菌群結(jié)構(gòu)使小鼠體重及激素分泌發(fā)生變化。

4　結(jié)　論

Nisin可提高盲腸菌群多樣性，降低血清、回腸和腦組織中ADAMTS1的含量和回腸中INS的含量，增加血清、空腸和腦組織中TC的含量，從而影響腹瀉小鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)及脂代謝。