丁修良 趙建飛 王 帥 于海濤 曾祥芳 陳紅羽 譙仕彥,4*
(1.北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司,北京 100193;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,北京 100193;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)動科學(xué)院,武漢 430070;4.北京生物飼料添加劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)
抗生素被廣泛用于動物生產(chǎn)已有60多年歷史[1]。在大型養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場,抗生素主要用于疾病的預(yù)防、治療和促進(jìn)生長。世界衛(wèi)生組織(WHO)2012年報(bào)道,全球被用于食用動物生產(chǎn)的抗生素超過抗生素總量的50%,且其中90%用于促生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率,給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了顯著的經(jīng)濟(jì)效益。但是,由于抗生素在生產(chǎn)實(shí)際中存在不合理以及濫用等現(xiàn)象,加之長期使用造成了細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性或不敏感性,細(xì)菌耐藥性問題導(dǎo)致越來越多的抗生素療效降低甚至無效,從而對畜禽、食品安全和人類公眾健康構(gòu)成重大威脅[2-3]。因此,尋找傳統(tǒng)抗生素替代物用于動物生產(chǎn)是迫切需要解決的任務(wù)。
抗菌肽(antimicrobial peptide,AMPs)是生物體產(chǎn)生的一類具有生物活性的小分子多肽,廣泛地存在于生物界,是重要的天然免疫和抗感染的宿主防御肽[4-5]??咕木哂袕V譜抗菌活性,廣泛地作用于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、病毒和原生動物。大多數(shù)抗菌肽通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性發(fā)揮抗菌活性,一些抗菌肽能夠穿透細(xì)胞膜并與胞內(nèi)不同的靶標(biāo)結(jié)合抑制細(xì)菌生長,且不易產(chǎn)生耐藥性,因此成為抗生素替代物研究的熱點(diǎn)[6-7]。
Sublancin是美國馬里蘭大學(xué)Hansen研究團(tuán)隊(duì)從枯草芽孢桿菌168菌株的發(fā)酵液中分離得到一種具有抑菌活性的物質(zhì),它是由37個氨基酸組成并含有2個二硫鍵的陽離子肽,其性質(zhì)極其穩(wěn)定,可以耐受1.5~9.5的pH,還可以在高溫環(huán)境中穩(wěn)定存在[8-10]。Sublancin具有抗革蘭氏陽性菌活性,其抗菌譜包括巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌等,對革蘭氏陰性菌無明顯抑菌效果[11-12]。Paik等[13]認(rèn)為Sublancin通過作用于細(xì)菌細(xì)胞膜合成的特定分子,使細(xì)胞膜形成孔洞,從而發(fā)揮其抗菌活性。Kouwen等[14]的研究發(fā)現(xiàn),Sublancin的抑菌活性與其對細(xì)菌膜機(jī)械敏感性離子通道有關(guān),Sublancin可能通過抑制這種離子通道的關(guān)閉,使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)快速溢出,從而使細(xì)菌裂解或死亡。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn),Sublancin可能通過抑制細(xì)菌的能量代謝而抑制細(xì)菌的分裂。目前關(guān)于Sublancin的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控、殺菌活性以及殺菌機(jī)制等方面。關(guān)于Sublancin作為飼料添加劑對肉雞生長性能和養(yǎng)分利用的作用效果尚未完全闡明。因此,本試驗(yàn)以健康肉雞和大腸桿菌感染肉雞為模型,研究Sublancin對肉雞生長性能、養(yǎng)分表觀代謝率、氮沉積和盲腸菌群的影響,旨在為抗菌肽Sublancin作為動物生產(chǎn)中抗生素替代品提供試驗(yàn)依據(jù)。
抗菌肽Sublancin由國家飼料工程技術(shù)研究中心構(gòu)建1個新型重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)W800中,獲得高效表達(dá)的Sublancin,再通過AKTA純化系統(tǒng)得到純度高達(dá)99.6%的Sublancin凍干粉樣品。其氨基酸序列為GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQNYRQFCR,分子質(zhì)量約為3 879.8 u。通過抑菌活性檢測凍干粉樣品的活性單位,確定相應(yīng)添加劑量。
本試驗(yàn)選用1日齡健康愛拔益加(AA)肉公雛為試驗(yàn)動物,平均初始體重為(41.90±3.21) g。試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧為參照我國《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制的玉米-豆粕型飼糧,其組成及營養(yǎng)水平見表1。所有飼糧均為粉料。
試驗(yàn)1:將432只1日齡AA肉公雛隨機(jī)分為4組,每組6個重復(fù),每個重復(fù)18只雞。對照組飼喂不含抗生素的基礎(chǔ)飼糧,抗生素組飼喂基礎(chǔ)飼糧+20 mg/kg硫酸黏桿菌素,低劑量抗菌肽組飼喂基礎(chǔ)飼糧+150 mg/kg Sublancin,高劑量抗菌肽組飼喂基礎(chǔ)飼糧+300 mg/kg Sublancin,試驗(yàn)期內(nèi)肉雞自由采食和飲水,試驗(yàn)持續(xù)42 d。整個飼養(yǎng)試驗(yàn)分為2個階段,1~21 d為前期,22~42 d為后期。
試驗(yàn)2:將288只1日齡AA肉公雛隨機(jī)分為3組,每組8個重復(fù),每個重復(fù)12只雞。對照組飼喂不含抗生素的基礎(chǔ)飼糧,抗生素組飼喂基礎(chǔ)飼糧+80 mg/kg金霉素,抗菌肽組飼喂基礎(chǔ)飼糧+300 mg/kg Sublancin。Sublancin添加劑量依據(jù)試驗(yàn)1的結(jié)果。試驗(yàn)期內(nèi)肉雞自由采食和飲水,試驗(yàn)持續(xù)28 d,第22天進(jìn)行大腸桿菌攻毒,即每只雞灌服大腸桿菌K88菌懸液(109CFU/mL)1 mL。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))
1)預(yù)混料為每千克飼糧提供Premix provided the following per kg of diets:Zn 60 mg,F(xiàn)e 95 mg,Cu 10 mg,I 0.35 mg,Se 0.3 mg,Mn 80 mg,VA 10 000 IU,VD32 750 IU,VE 30 IU,VK32 mg,VB1212 μg,核黃素 riboflavin 6 mg,尼克酸 nicotinic acid 40 mg,泛酸 pantothenic acid 12 mg,吡哆醇 pyridoxine 3 mg,生物素 biotin 0.2 mg,氯化膽堿 choline chloride 800 mg。
2)計(jì)算值Calculated values。
試驗(yàn)雞采用3層籠(90 cm×40 cm)平養(yǎng),滴頭式飲水器,自由采食和飲水,電腦控制溫濕度,人工調(diào)節(jié)光照。試驗(yàn)前3 d室溫控制在33 ℃,隨后溫度每周下降3 ℃直到24 ℃恒溫。24 h光照,保持良好通風(fēng)。所有肉仔雞在試驗(yàn)第7天和第28天時接種新城疫疫苗,第14天和第21天時接種傳染性法氏囊疫苗。試驗(yàn)于農(nóng)業(yè)部飼料效價(jià)與安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(北京)畜禽試驗(yàn)基地進(jìn)行,所有操作均按照中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物福利的相關(guān)程序和要求執(zhí)行。
1.4.1試驗(yàn)1
1.4.1.1生長性能的測定
在試驗(yàn)第1天、第21天和第42天,對試驗(yàn)雞只進(jìn)行稱重,并記錄耗料量,用于計(jì)算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)、平均日增重(average daily gain,ADG)和飼料轉(zhuǎn)化率(feed conversion ratio,F(xiàn)CR)。
1.4.1.2盲腸菌群的測定
于試驗(yàn)第21天和第42天,每個重復(fù)隨機(jī)抽取1只雞,屠宰,取盲腸食糜,用紗布包好于-80 ℃速凍待測,所選雞只體重見表2。
將盲腸食糜在常溫下解凍,混勻,無菌稱取盲腸食糜樣品0.5 g,溶解于4.5 mL無菌生理鹽水中,充分混合,然后逐級稀釋至10-7。選擇10-3~10-7的稀釋度,取0.1 mL稀釋液接種到厭氧滾管中進(jìn)行乳酸桿菌培養(yǎng);選擇10-2~10-4的稀釋度,取0.2 mL稀釋液于平板培養(yǎng)基中進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng);選擇10-4~10-8的稀釋度,取0.2 mL稀釋液于平板培養(yǎng)基中進(jìn)行總需氧菌培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中,其中乳酸菌和大腸桿菌培養(yǎng)24 h,總需氧菌培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。每個稀釋度設(shè)2個重復(fù),選擇30~300個菌落的平板或者滾管做計(jì)數(shù)用。
大腸桿菌的培養(yǎng)采用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)基組成及pH如下:蛋白胨,20.0 g/L;乳糖,10.0 g/L;膽鹽,5.0 g/L;氯化鈉,5.0 g/L;中性紅,0.075 g/L;瓊脂,20.0 g/L;pH,7.4±0.2。乳酸桿菌的培養(yǎng)采用MRS瓊脂培養(yǎng)基、總需氧菌的培養(yǎng)采用平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基,上述培養(yǎng)基均購自英國OXIDE公司。
1.4.2試驗(yàn)2
1.4.2.1生長性能的測定
在試驗(yàn)第1天、第21天,對試驗(yàn)雞只進(jìn)行稱重,并記錄耗料量,用于計(jì)算ADFI、ADG和FCR。
1.4.2.2養(yǎng)分表觀代謝率與氮沉積的測定
于試驗(yàn)第19~21天收集糞尿,將其混勻,稱重,60 ℃烘48 h,粉碎至40目用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)養(yǎng)分分析。飼料和糞尿樣品中的干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量依照AOAC(2006)的標(biāo)準(zhǔn)方法測定,總能采用氧彈式熱量計(jì)(Parr 1281,美國)測定,進(jìn)而計(jì)算各養(yǎng)分的表觀代謝率。記錄試驗(yàn)第19~21天的采食量,以及第19~21天的糞尿重,測定飼料和糞尿氮含量后計(jì)算氮沉積量和氮沉積率。
氮沉積量(g/d)=氮攝入量-糞尿氮排放量;
氮沉積率(%)=100×氮沉積量/氮攝入量。
1.4.2.3盲腸菌群測定
于試驗(yàn)第28天時,每個重復(fù)隨機(jī)抽取1只雞屠宰,取盲腸食糜,用紗布包好于-80 ℃速凍待測,雞只體重見表2。盲腸中乳酸桿菌、大腸桿菌的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法同1.4.1.2。
表2 試驗(yàn)1與試驗(yàn)2用于盲腸菌群分析的肉雞體重
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.
數(shù)據(jù)采用SAS 9.2的一般線性模型(GLM)中的ANOVA方法進(jìn)行分析,所有指標(biāo)以重復(fù)為單位。若組間存在顯著差異,則用Student-Newman-Keuls test多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值以及均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)來表示,P<0.05為差異顯著。
2.1.1生長性能
由表3可知,在試驗(yàn)前期(1~21 d),與對照組相比,飼糧添加150和300 mg/kg抗菌肽Sublancin或20 mg/kg抗生素硫酸黏桿菌素顯著提高了肉雞的ADG(P<0.05),并顯著改善了FCR(P<0.05)。抗生素組和抗菌肽組肉雞的ADG和FCR沒有顯著差異(P>0.05)。在試驗(yàn)后期(22~42 d),與對照組相比,飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin顯著提高了肉雞的ADG(P<0.05)。與150 mg/kg Sublancin組和對照組相比,飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或20 mg/kg抗生素硫酸黏桿菌素顯著改善了FCR(P<0.05)。整個試驗(yàn)期間(1~42 d),與對照組相比,飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin顯著提高了肉雞的ADG(P<0.05),并顯著改善了FCR(P<0.05)??股亟M和抗菌肽組肉雞的ADG和FCR沒有顯著差異(P>0.05)。飼糧中添加抗菌肽Sublancin和抗生素硫酸黏桿菌素對任何階段肉雞的ADFI均無顯著影響(P>0.05)。
2.1.2盲腸菌群
由表4可知,與對照組相比,飼糧添加150和300 mg/kg抗菌肽Sublancin或20 mg/kg抗生素硫酸黏桿菌素顯著降低試驗(yàn)第21天和第42天肉雞盲腸中大腸桿菌和總需氧菌的數(shù)量(P<0.05);但是,150和300 mg/kg Sublancin組之間上述指標(biāo)不存在顯著差異(P<0.05)。與150 mg/kg Sublancin組相比,飼糧添加20 mg/kg抗生素硫酸黏桿菌素顯著降低了試驗(yàn)第21天和第42天肉雞盲腸中大腸桿菌和總需氧菌的數(shù)量(P<0.05)。飼糧中添加抗菌肽Sublancin和抗生素硫酸黏桿菌素對試驗(yàn)第21天和第42天肉雞盲腸中乳酸桿菌數(shù)量無顯著影響(P>0.05)。
表3 試驗(yàn)1:抗菌肽Sublancin對肉雞生長性能的影響
表4 試驗(yàn)1:抗菌肽Sublancin對肉雞盲腸菌群的影響
2.2.1生長性能
由表5可知,與對照組相比,飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素顯著提高了肉雞的ADG,并顯著改善了FCR(P<0.05),但對肉雞的ADFI沒有顯著影響(P>0.05)??咕慕M與抗生素組肉雞的生長性能無顯著差異(P>0.05)。
2.2.2養(yǎng)分表觀代謝率與氮沉積
由表6可知,與對照組相比,飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素對干物質(zhì)和能量表觀代謝率沒有顯著影響(P>0.05),但顯著提高了粗蛋白質(zhì)表觀代謝率(P<0.05);抗菌肽組肉雞的養(yǎng)分表觀代謝率與抗生素組沒有顯著差異(P>0.05)??咕慕M肉雞的氮沉積量顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05),達(dá)到8.49 g/d。與對照組相比,飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素顯著提高了氮沉積率(P<0.05),但抗菌肽組與抗生素組之間沒有顯著差異(P>0.05)。
表5 試驗(yàn)2:抗菌肽Sublancin對肉雞生長性能的影響
表6 試驗(yàn)2:抗菌肽Sublancin對肉雞養(yǎng)分表觀代謝率和氮沉積的影響
2.2.3盲腸菌群
由表7可知,與對照組相比,飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素顯著降低了感染大腸桿菌K88肉雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量(P<0.05);抗菌肽組感染大腸桿菌K88肉雞盲腸中大腸桿菌數(shù)量與抗生素組無顯著差異(P>0.05)。飼糧添加抗菌肽Sublancin和抗生素金霉素對感染大腸桿菌K88肉雞盲腸中乳酸桿菌數(shù)量沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。
表7 試驗(yàn)2:抗菌肽sublancin對感染大腸桿菌K88肉雞盲腸菌群的影響
由于抗生素耐藥性問題日趨嚴(yán)重,關(guān)于抗生素替代品的研究顯得越來越重要[15]。抗菌肽因其獨(dú)有的生物學(xué)特性和抗菌機(jī)制,很有潛力替代抗生素,給臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品加工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域帶來革命性進(jìn)展[16-18]。Bals等[19]研究顯示,抗菌肽可促進(jìn)動物生長,提高動物抗病能力。溫劉發(fā)等[20]研究發(fā)現(xiàn),在仔豬斷奶料里添加抗菌肽,抗菌肽的抗腹瀉效果與抗生素?zé)o顯著差異,且適量的抗菌肽比抗生素的促生長效果好。陳曉生等[21]研究表明,在肉鴨飼糧中添加天蠶素AD-酵母制劑顯著增強(qiáng)了血清代謝激素活動,胰島素樣生長因子-1(IGF-1)濃度增高,營養(yǎng)物質(zhì)合成加快;尿素氮濃度顯著降低,體內(nèi)氮排出減少,同時對免疫器官并未產(chǎn)生副作用。王廣軍等[22]的研究表明,在飼料中添加抗菌蛋白后,南美白對蝦的日生長速度、相對增重率、飼料轉(zhuǎn)化率、成活率和抗病力均有顯著提高。由此可見,抗菌肽具有代替抗生素成為新型飼料添加劑的潛能。
本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽Sublancin具有一定的體外和體內(nèi)抑菌活性。給小鼠口服抗菌肽Sublancin后發(fā)現(xiàn),抗菌肽Sublancin可以誘導(dǎo)卵清蛋白(OVA)免疫小鼠產(chǎn)生Th1和Th2混合型免疫反應(yīng),增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[23]。但是,目前關(guān)于抗菌肽Sublancin替代抗生素在肉雞生產(chǎn)和疾病控制中的作用的報(bào)道較少。因此,本試驗(yàn)在已有研究工作基礎(chǔ)上,以肉雞為研究對象,進(jìn)一步探討抗菌肽Sublancin對其生長性能及腸道菌群的影響,基于以上研究結(jié)果再通過灌服大腸桿菌等應(yīng)激措施,觀察飼糧中添加抗菌肽Sublancin對肉雞生長性能、養(yǎng)分利用以及腸道菌群的影響,旨在為抗菌肽Sublancin作為替代抗生素在飼料添加劑方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
硫酸黏桿菌素和金霉素曾長期作為促生長劑用于畜禽生產(chǎn)[17,24],并起到了良好的效果。但由于硫酸黏桿菌素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告禁止使用。所以很多研究學(xué)者開始尋找新的替代物,本試驗(yàn)選擇硫酸黏桿菌素和金霉素作為陽性對照的目的是研究抗菌肽Sublancin能否作為新型添加劑替代硫酸黏桿菌素和金霉素用于畜禽生產(chǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),飼糧中添加抗菌肽Sublancin能夠改善肉雞的生長性能。這一結(jié)果與王萬云等[25]和盧宇等[26]的研究結(jié)果一致,即肉雞飼糧中添加抗菌肽可顯著提高生產(chǎn)效率。此外,Choi等[27]的研究發(fā)現(xiàn),在肉雞飼糧中添加合成抗菌肽-p5提高了肉雞的ADG和FCR。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),飼糧中添加抗菌肽Sublancin對肉雞的ADFI無顯著影響。這一結(jié)果與Bao等[28]和Ohh等[29]的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中,飼糧中添加抗菌肽Sublancin和抗生素硫酸黏桿菌素與金霉素能夠同等改善肉雞的生長性能,這表明抗菌肽Sublancin有潛力作為肉雞飼糧中抗生素的替代品。這一結(jié)果與Ohh等[29]和Choi等[27]的研究結(jié)果一致。抗生素的促生長機(jī)制包括抑制病原菌、降低亞臨床病原菌的侵染以及通過調(diào)控微生物組成減少腸道菌群的營養(yǎng)競爭[16-17,30]。在本研究中飼糧添加抗菌肽Sublancin提高了肉雞的生長性能可能是由于提高了養(yǎng)分的吸收利用和減少腸道中有害微生物數(shù)量。
從試驗(yàn)1中我們發(fā)現(xiàn)飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin顯著改善了肉雞的生長性能。在進(jìn)一步研究的試驗(yàn)2中我們發(fā)現(xiàn)飼糧添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin顯著增加了肉雞的氮沉積。Ohh等[29]和Choi等[27,31]的研究均發(fā)現(xiàn)肉雞飼糧中添加抗菌肽可提高氮沉積,進(jìn)而改善生長性能。本試驗(yàn)中,飼糧中添加抗菌肽對干物質(zhì)和能量的表觀代謝率沒有顯著影響。這一結(jié)果與Ohh等[29]和Choi等[27,31]所得結(jié)果相似。從盲腸菌群結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常肉雞飼糧中添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或20 mg/kg抗生素硫酸黏桿菌素顯著減少了盲腸中大腸桿菌的數(shù)量。在大腸桿菌K88攻毒條件下,飼糧中添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin或80 mg/kg抗生素金霉素顯著減少了盲腸中大腸桿菌的數(shù)量,與Wu等[24]的研究結(jié)果相似。由此表明,抗菌肽Sublancin可能具有抑制腸道內(nèi)有害細(xì)菌增殖的作用,從而提高肉雞的抗感染能力。
除了直接的抗菌作用,抗菌肽還能通過抑制微生物增殖來間接調(diào)節(jié)免疫功能,包括免疫細(xì)胞的募集,從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和降低感染的程度。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),抗菌肽Sublancin通過降低腸道核因子-κB(NF-κB)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá),減輕腸道損傷,減少金黃色葡萄球菌感染小鼠的死亡率[11,30]。除此之外,本實(shí)驗(yàn)室前期研究還發(fā)現(xiàn),抗菌肽Sublancin降低了小鼠回腸促炎因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平[30]。然而,關(guān)于抗菌肽Sublancin是否調(diào)控了宿主的免疫功能以及對宿主盲腸菌群的影響是否與免疫功能相關(guān)有待進(jìn)一步探討。
抗菌肽Sublancin用于肉雞飼糧中抗生素替代物具有潛在的價(jià)值。飼糧中添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin可通過提高養(yǎng)分利用率,減少腸道有害細(xì)菌數(shù)量來提高肉雞的生長性能。