白藜蘆醇通過沉默調(diào)節(jié)蛋白1-解偶聯(lián)蛋白2信號通路降低小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM3的氧化損傷

張曉春　陳指龍　方　娟　黎　陳　伍小松　楊　青*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

當(dāng)機體遭受體內(nèi)外各種有害刺激時，由于機體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，機體內(nèi)活性氧(ROS)會大量聚集，使組織細胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物，從而引起細胞的氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)氧化損傷可引起動物嚴(yán)重的生精障礙，導(dǎo)致睪丸組織發(fā)生明顯的病理變化，睪丸指數(shù)和精子數(shù)下降，精子畸形率升高，造成雄性動物不育[1-2]。白藜蘆醇(RES)是一種廣泛存在于葡萄、花生、虎杖、決明、藜蘆等植物性食物中的天然多酚類物質(zhì)，具有很廣泛的生物學(xué)活性，在治療氧化損傷、炎癥、過敏、腫瘤、心血管疾病等方面都得以應(yīng)用[3-4]。目前，RES在畜禽生產(chǎn)中也被廣泛應(yīng)用，它能提高畜禽的生產(chǎn)性能、改善畜禽酮體品質(zhì)和肉品質(zhì)、提高畜禽免疫力和抗氧化能力[5]。高糖高膽固醇飲食可導(dǎo)致小鼠睪丸間質(zhì)細胞的睪酮合成能力受損，添加RES能夠通過減輕其氧化應(yīng)激，并通過激活沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)及影響下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控發(fā)揮保護作用[6]。成海建等[7]研究發(fā)現(xiàn)RES可通過激活SIRT1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路促進牛皮下脂肪細胞的凋亡。周曦等[8]研究發(fā)現(xiàn)RES可能通過調(diào)控SIRTl/解偶聯(lián)蛋白2(UCP-2)信號通路抑制血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷。SIRT1具有去乙?；富钚?，通過對組蛋白、多種轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄共調(diào)控因子的翻譯后修飾(去乙?；?，可調(diào)節(jié)與氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥反應(yīng)相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[9]。UCP2作為解偶聯(lián)蛋白，能影響線粒體的跨膜電位，當(dāng)線粒體內(nèi)膜電勢升高時，UCP2能夠降低細胞膜內(nèi)外氫離子(H+)濃度，促進氧消耗，從而抑制ROS的產(chǎn)生[10]。目前，雖已明確RES的抗氧化作用效果，但對于其具體的作用機制尚未完全明確。因此，本研究以小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM3為研究對象，在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下研究RES對氧化損傷細胞的治療作用，并闡明其可能的作用機制，以期為防治由氧化損傷引起的雄性生殖系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.2　試驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM3細胞株用DMEM/F12培養(yǎng)基(添加10%的胎牛血清和1%青-鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基，待細胞長至對數(shù)生長期即匯合度達到80%～90%時，使用胰酶消化制備細胞懸液。

1.2.2iCELLigence細胞功能分析儀監(jiān)測細胞增殖情況

將細胞消化離心后，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，制備成密度為2.5×104個/mL的細胞懸液待用。在E-Plate L8板中加入含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(150 μL/孔)，放入iCELLigence實時無標(biāo)記細胞功能分析儀(Roche，德國)，在儀器配備的iPad軟件中，選擇增殖試驗，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基自動調(diào)零。隨后取出E-Plate L8板，每孔加入細胞懸液300 μL，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，待細胞靜置30 min后將E-Plate L8板重新放置于iCELLigence實時無標(biāo)記細胞功能分析儀內(nèi)，點擊開始進行實時監(jiān)測。具體操作過程中：1)在確定建立氧化損傷細胞模型的適宜H2O2濃度的試驗中，待細胞生長曲線進入對數(shù)期后(即在培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后)，將E-Plate L8取出，輕輕吸出100 μL培養(yǎng)基，再加入100 μL含不同濃度H2O2的培養(yǎng)基，使終濃度分別0(正常對照組)、150、200、250和300 μmol/L，輕輕混勻后再將E-Plate L8板置于分析儀中，繼續(xù)監(jiān)測8 h，此過程共監(jiān)測32 h。2)在確定RES安全濃度的試驗中，待細胞生長曲線進入對數(shù)期后(即在培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后)，將E-Plate L8取出，分別采用0(正常對照組)、2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES處理，繼續(xù)監(jiān)測24 h，此過程共監(jiān)測48 h。3)在RES干預(yù)處理氧化損傷細胞的試驗中，待細胞生長曲線進入對數(shù)期后(即在培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后)，先將細胞用150 μmol/L的H2O2處理8 h，再分別用0(H2O2組)、2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES處理，同時設(shè)未經(jīng)H2O2和RES處理的正常對照組，繼續(xù)監(jiān)測24 h，此過程共監(jiān)測56 h。設(shè)置iCELLigence系統(tǒng)每隔15 min實時監(jiān)測細胞增殖情況，制作增殖曲線，不同曲線可反映不同處理條件下細胞實時增殖情況，細胞增殖情況用增殖指數(shù)(proliferation index，PI)表示。在監(jiān)測結(jié)束時測定各個培養(yǎng)板中細胞的存活率。

1.2.32′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)探針法檢測細胞中ROS含量

待RES(5.0 μmol/L)處理氧化損傷細胞結(jié)束后，按照ROS檢測試劑盒說明書測定細胞中ROS含量，具體操作如下：去掉培養(yǎng)上清液，加入含10 μmol/L DCFH-DA探針的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃孵育細胞40 min，用胰酶消化細胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1次，離心留細胞沉淀，用PBS重懸細胞，調(diào)整細胞密度為6×105個/mL，使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為525 nm處檢測熒光強度。DCFH-DA本身沒有熒光，當(dāng)其進入細胞后被酯酶水解為DCFH，而DCFH可被細胞內(nèi)的ROS氧化為強綠色熒光物質(zhì)DCF，因此，其熒光強度與細胞內(nèi)ROS的含量成正比，可用熒光強度表示ROS含量。

1.2.4實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)檢測細胞中SIRT1和UCP2的mRNA相對表達量

表1　實時熒光定量PCR引物序列

F和R分別代表上游和下游引物。

F and R represent forward and reverse primers, respectively.

1.2.5蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)法檢測細胞中SIRT1和UCP2的蛋白質(zhì)相對表達量

待RES處理氧化損傷細胞結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，加入200 μL RIPA細胞裂解液(含1% PMSF)，吹打均勻，冰上放置30 min，期間劇烈振蕩3次，每次30 s，將細胞裂解液置于4 ℃，12 000 r/min離心10 min后吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白質(zhì)濃度的測定。取適量蛋白質(zhì)樣品用5 Loading Buffer混勻，100 ℃水浴中煮5 min使蛋白質(zhì)變性。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，每孔上樣量為30 μg，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用0.2%明膠室溫搖床封閉1 h，分別加入不同的一抗4 ℃孵育過夜；用三羥甲基氨基甲烷吐溫(TBST)洗膜3次，每次10 min；加入相對應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后用ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯色，于ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)中檢測蛋白質(zhì)條帶并用Quantity One軟件分析條帶的密度值和表達量，以β-actin為內(nèi)參。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行方差分析，采用LSD法進行兩兩比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　H2O2對TM3細胞增殖的影響

不同濃度H2O2處理TM3細胞8 h后，根據(jù)iCELLigence細胞功能分析儀實時監(jiān)測結(jié)果(圖1)可知，與正常對照組相比，各濃度H2O2組的細胞存活率均極顯著下降(P<0.01)，且呈濃度依賴。其中用150 μmol/L的H2O2處理時細胞存活率下降至75%左右，達到預(yù)計的損傷效果。因此，在后續(xù)試驗中選用150 μmoL/L的H2O2處理細胞8 h構(gòu)建本試驗中所需的氧化損傷細胞模型。

A：iCELLigence細胞功能分析儀實時監(jiān)測H2O2對TM3細胞增殖的影響。B：不同濃度H2O2處理TM3細胞8 h后對細胞增殖的影響。

A： real-time monitor the effect of H2O2on proliferation of TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of different concentrations of H2O2on proliferation of TM3 cells after treated for 8 h.

數(shù)據(jù)柱標(biāo)“**”表示與正常對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

Value columns of each with “**” mean extremely significant difference compared with the normal control group (P<0.01). The same as below.

圖1不同濃度H2O2對TM3細胞增殖的影響

Fig.1Effects of different concentrations of H2O2on proliferation of TM3 cells

2.2　RES對TM3細胞增殖的影響

為研究RES對H2O2致TM3細胞氧化損傷的作用效果，首先檢測了RES對TM3細胞增殖的影響，由圖2可知，用濃度分別為2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES處理正常細胞24 h后，各濃度RES組與正常對照組的細胞存活率無顯著差異(P>0.05)。由圖3可知，當(dāng)用RES處理氧化損傷細胞24 h后，與H2O2組(僅經(jīng)H2O2單獨處理，未經(jīng)RES處理的氧化損傷細胞)相比，各濃度RES組的細胞存活率均顯著提高(P<0.05)，但仍無法恢復(fù)到正常對照組水平，且各濃度RES組間無顯著差異(P>0.05)，因此，后續(xù)試驗中選取濃度為5 μmol/L的RES對氧化損傷TM3細胞進行處理。

2.3　RES對氧化損傷TM3細胞中ROS含量的影響

由圖4可知，正常細胞經(jīng)H2O2的處理后，細胞內(nèi)相對熒光強度極顯著增強(P<0.01)，即表明細胞中ROS含量顯著升高；而氧化損傷細胞經(jīng)RES處理后，細胞內(nèi)相對熒光強度極顯著下降(P<0.01)，但仍無法恢復(fù)至正常對照組的水平。這說明RES能夠在一定程度上抑制氧化損傷TM3細胞中ROS的產(chǎn)生。

A：iCELLigence細胞功能分析儀實時監(jiān)測RES對TM3細胞增殖的影響。B：不同濃度RES處理TM3細胞24 h后對細胞增殖的影響。

A： real-time monitor the effects of RES on proliferation of TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of different concentrations of RES on proliferation of TM3 cells after treated for 24 h.

圖2不同濃度RES對TM3細胞增殖的影響

Fig.2Effects of different concentrations of RES on proliferation of TM3 cells

A：iCELLigence細胞功能分析儀實時監(jiān)測RES對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細胞增殖的影響。B：RES處理24 h對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細胞增殖的影響。

A： real-time monitor the effects of RES on proliferation of H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of RES on proliferation of H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells after treated for 24 h.

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“#”表示與H2O2組相比差異顯著(P<0.05)。

Value columns with “#” mean significant difference compared with H2O2group (P<0.05).

圖3RES對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細胞增殖的影響

Fig.3Effects of RES on proliferation of oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

2.4　RES對氧化損傷TM3細胞中SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白質(zhì)相對表達量的影響

由圖5-A可知，正常細胞經(jīng)H2O2的處理后，細胞中SIRT1 mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，UCP2 mRNA相對表達量極顯著增加(P<0.01)。而氧化損傷細胞經(jīng)RES處理后，細胞中SIRT1 mRNA相對表達量極顯著增加(P<0.01)，UCP2 mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)。由圖5-B可知，細胞中SIRT1和UCP2蛋白質(zhì)相對表達量的變化趨勢與其mRNA相對表達量變化趨勢一致，即H2O2處理導(dǎo)致SIRT1蛋白質(zhì)相對表達量極顯著降低(P<0.01)，而使UCP2蛋白質(zhì)相對表達量表達極顯著增加(P<0.01)；RES處理可極顯著提高氧化損傷細胞中SIRT1蛋白質(zhì)相對表達量(P<0.01)，顯著降低UCP2蛋白質(zhì)相對表達量(P<0.05)。

3　討　論

3.1　H2O2誘導(dǎo)TM3細胞氧化損傷模型的建立

目前，在細胞氧化損傷模型的建立中，多以H2O2作為誘導(dǎo)劑，不同類型的細胞對誘導(dǎo)劑的敏感性不一樣，因此誘導(dǎo)劑的濃度和處理時間非常關(guān)鍵[11-12]。當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度過高或處理時間過長時會導(dǎo)致細胞損傷太嚴(yán)重，不利于抗氧化機制的研究；而當(dāng)損傷程度太弱時，細胞可能通過自身修復(fù)影響相關(guān)的研究。對于細胞氧化損傷模型，一般通過噻唑藍(MTT)法檢測，根據(jù)其吸光度值來判斷細胞增殖情況從而確定氧化損傷程度，MTT法雖然有其優(yōu)勢，如重復(fù)性較好、特異性強等，但每次只能確定1個時間點細胞的增殖情況。本試驗中采用iCELLigence細胞功能分析儀實時監(jiān)測，可更直觀地判斷細胞的增殖情況，而且監(jiān)測過程中不需要特殊試劑，可減少因多次操作所導(dǎo)致的誤差。本試驗中，通過iCELLigence細胞功能分析儀實時監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)150 μmol/L的H2O2處理細胞8 h，細胞存活率下降至75%左右，符合后續(xù)抗氧化損傷試驗的要求，因此確定采用150 μmol/L的H2O2建立細胞氧化損傷模型。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“##”表示與H2O2組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

Value columns with “##” mean extremely significant difference compared with H2O2group (P<0.01). The same as below.

圖4RES對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細胞中ROS含量的影響

Fig.4Effects of RES on ROS content in oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

A：qPCR檢測RES對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細胞中SIRT1和UCP2 mRNA相對表達量的影響。B：Western-blot法檢測RES對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷TM3細胞中SIRT1和UCP2蛋白質(zhì)相對表達量的影響。

A：detection of the mRNA relative expression levels ofSIRT1 andUCP2 in H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells with treatment of RES by qPCR. B： detection of the protein relative expression levels of SIRT1 and UCP2 in H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells with treatment of RES by Western-blot method.

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)“**”表示與正常對照組相比差異極顯著(P<0.01)，肩標(biāo)“##”表示與H2O2組相比差異極顯著(P<0.01)，肩標(biāo)“##”表示與H2O2組相比差異顯著(P<0.05)。

Values in the same line with “**” superscript means extremely significant difference compared with the normal control group (P<0.01)， with “##” superscript means extremely significant difference compared with the H2O2group (P<0.01)， and with “#” superscript means significant difference compared with the H2O2group (P<0.05).

圖5RES對H2O2氧化損傷TM3細胞中SIRT1和UCP2mRNA及蛋白質(zhì)相對表達量的影響

Fig.5Effects of RES on mRNA and protein relative expression levels ofSIRT1 andUCP2 in oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

3.2　RES對氧化損傷細胞的保護作用

研究表明，動物體中90%的ROS源于線粒體電子呼吸傳遞鏈，ROS的產(chǎn)生與線粒體能量代謝緊密相關(guān)，當(dāng)ROS含量增加時，會對線粒體的結(jié)構(gòu)、功能造成損傷，而線粒體受到損傷后又會促進ROS的生成，如此惡性循環(huán)，加重氧化損傷程度[13-14]。解偶聯(lián)蛋白(UCPs)是位于線粒體內(nèi)膜上的一類轉(zhuǎn)運蛋白，它們可以介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的“質(zhì)子漏”使能量以熱的形式散失[15]。UCP2作為UCPs家族成員之一，是UCPs在生殖系統(tǒng)中的主要存在形式[16-17]。大量試驗表明，UCP2可以調(diào)控ROS的生成，并參與多種組織的抗氧化損傷作用。Brand[18]提出了UCP2對ROS的負調(diào)控假設(shè)模型，當(dāng)ROS含量增加時，過氧化物在化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的某種物質(zhì)激活UCP2的質(zhì)子漏活性，導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，UCP2就以一種負反饋調(diào)節(jié)的方式來限制ROS的生成，表明在氧化應(yīng)激過程中，UCP2可以通過降低ROS的生成量保護機體免受過氧化損傷。同樣的結(jié)論在Zhang等[19]、王曉娜等[20]的試驗中也得到證實。Zhang等[19]的試驗表明，高溫誘導(dǎo)的凋亡能引起小鼠睪丸內(nèi)ROS含量增加，UCP2蛋白質(zhì)表達量也隨之增加；王曉娜等[20]試驗發(fā)現(xiàn)，精子內(nèi)UCP2蛋白質(zhì)的表達量與過氧化氫的作用濃度呈正相關(guān)，UCP2為了對抗增加的ROS，表達量也隨之增加。SIRT1作為一種核蛋白，能夠以轉(zhuǎn)錄的形式抑制UCP2的轉(zhuǎn)錄活性，通過與UCP2啟動子結(jié)合，抑制UCP2基因的表達，減少其編碼的線粒體內(nèi)膜蛋白的生成，從而抑制線粒體中解偶聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[21]。相關(guān)研究表明，經(jīng)不同藥物誘導(dǎo)的大鼠或小鼠氧化應(yīng)激模型中，SIRT1都表現(xiàn)出低表達狀態(tài)，而SIRT1一經(jīng)激活，可導(dǎo)致UCP2的表達下降[8,22-23]。結(jié)合以上信息推測，在本試驗中，RES通過對SIRT1/UCP2信號通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮對氧化損傷小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM3的保護作用。

本試驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，H2O2組細胞中ROS含量極顯著增加，SIRT1 mRNA及蛋白質(zhì)的相對表達量均極顯著降低，而UCP2 mRNA及蛋白質(zhì)的相對表達量極顯著升高，提示細胞被H2O2損傷后細胞中SIRT1含量的降低可能誘導(dǎo)UCP2含量的增加，以抵抗細胞中增加的ROS。UCP2生成量增加，解偶聯(lián)線粒體內(nèi)氧化磷酸化過程，減少ATP的生成，ROS的生成量應(yīng)該下降，但氧化應(yīng)激在細胞中UCP2表達增強的情況下仍持續(xù)存在，推測可能是由于UCP2增加的量不足以抵抗ROS的過量產(chǎn)生。相比氧化損傷細胞，采用RES處理后由H2O2所致的SIRT1 mRNA及蛋白質(zhì)表達的下調(diào)和UCP2 mRNA及蛋白質(zhì)表達的上調(diào)均在一定程度上受到抑制，且細胞中ROS含量也極顯著下降，提示RES作為SIRT1的激活劑，能夠促進其表達。SIRT1被激活后，可抑制UCP2的表達，理論上應(yīng)該會產(chǎn)生更多的ROS，但實際采用RES處理后氧化損傷細胞中ROS的含量相對未經(jīng)RES處理的氧化損傷細胞而言是減少的，分析原因可能是UCP2對ROS存在負反饋調(diào)節(jié)，即UCP2表達被抑制后，細胞中ROS的含量增加，UCP2通過負反饋調(diào)節(jié)的方式限制ROS的產(chǎn)生。

此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在正常TM3細胞中UCP2 mRNA的表達較豐富，而其蛋白質(zhì)較難檢測到，而經(jīng)H2O2損傷后TM3細胞中UCP2蛋白質(zhì)的相對表達量極顯著增加。這種情況的出現(xiàn)可能與抗體的特異性有關(guān)；也可能是在生理狀態(tài)下，某些器官中的UCP2 mRNA并不最終表達為蛋白質(zhì)，而在病理狀態(tài)下就可以啟動UCP2 mRNA翻譯為蛋白質(zhì)。在Fisler等[24]的研究中也在胰腺、脾臟、心臟、下丘腦、肺、睪丸、巨噬細胞等檢測到大量的UCP2 mRNA，而用Western blot法僅在下丘腦、巨噬細胞、白色脂肪組織、脾臟、胰島的實質(zhì)細胞中檢測到了UCP2蛋白質(zhì)。

4　結(jié)　論

SIRT1/UCP2信號通路介導(dǎo)了H2O2致TM3細胞的氧化損傷，RES通過活化SIRT1抑制UCP2表達，UCP2通過負反饋調(diào)節(jié)方式削弱氧化損傷細胞內(nèi)ROS的生成，從而在一定程度上抑制TM3細胞的氧化損傷。