熱休克蛋白70在牦牛胃中的分布和表達(dá)

楊曉晴　崔　燕　何俊峰　楊　雪　劉鵬剛　廖　博　李　慧　孫　娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

熱休克蛋白70(heat shock protein,HSP70)是機(jī)體在不良因素刺激下產(chǎn)生的一類特殊應(yīng)激蛋白，普遍存在于自然界生物體內(nèi)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、抗凋亡、抗應(yīng)激及參與免疫應(yīng)答等多種重要生理功能[1-3]。近年來，HSP70在胃腸道的研究為胃腸道疾病的治療提供了重要的線索和依據(jù)，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)HSP70在胃中的研究主要集中于大鼠[4]、小鼠[5]、豬[6]及人[7]等單胃動(dòng)物，其在反芻動(dòng)物胃中的分布及表達(dá)量尚不清楚。牦牛(Bosgrunniens)是生活在我國(guó)青藏高原地區(qū)的反芻動(dòng)物，采食較為粗糙的牧草，這對(duì)胃黏膜損傷較大[8]。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70作為胃腸黏膜細(xì)胞的分子伴侶，對(duì)胃腸黏膜細(xì)胞有重要的保護(hù)作用[9]。因此，本試驗(yàn)采用免疫組化及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting, WB)法檢測(cè)HSP70在牦牛各胃的分布特征及表達(dá)量的差異性變化，旨在進(jìn)一步探究HSP70對(duì)牦牛胃的保護(hù)作用，為牦牛胃的新陳代謝及生理機(jī)能研究提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

2016年9月從青海西寧屠宰場(chǎng)選擇8頭健康成年(3～5歲)牦牛，雌雄各占1/2，體重為(600～900) kg。經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死后，迅速剪切瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃及皺胃組織，去掉內(nèi)容物后用無菌生理鹽水沖洗干凈。一部分組織樣品浸于4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)中，以備制作石蠟切片；另一部分組織樣品快速放入液氮中，待后期移至-80 ℃保存，用于提取蛋白質(zhì)。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1組織學(xué)方法及免疫組化法檢測(cè)HSP70在牦牛各胃的分布

將固定好的組織樣品制成石蠟切片，切片厚度為4 μm。用以下3種方法對(duì)其進(jìn)行染色：1)嗜銀染色(Gordon sweet)，觀察并定位皺胃組織中的內(nèi)分泌細(xì)胞。2)阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫(Alcian blue-periodic acid-Schiff,AB-PAS)染色，進(jìn)一步觀察并定位皺胃組織中的分泌細(xì)胞。3)使用HSP70兔多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)按1∶1 000稀釋后，進(jìn)行免疫組化切片染色，具體方法參照SP試劑盒說明書進(jìn)行。用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mol/L)代替一抗作陰性對(duì)照，蘇木精復(fù)染，酒精梯度脫水，封片，用Olympus-DP71型光學(xué)顯微系統(tǒng)觀察其陽(yáng)性反應(yīng)并拍照。

1.2.2WB法檢測(cè)HSP70在牦牛各胃的表達(dá)量

將蛋白質(zhì)樣品調(diào)為同一濃度后，按各比例分別加入4×十二烷基硫酸鈉(SDS)的上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，使蛋白質(zhì)變性后放入4 ℃保存。待分離膠和濃縮膠制好后加樣，每孔蛋白質(zhì)樣品上樣量為15 μL，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，當(dāng)電泳至分離膠與濃縮膠交界處時(shí)更換電壓，電壓由原來的80 V切換為150 V。電泳結(jié)束后，根據(jù)Marker條帶切下目的蛋白所處的膠冰浴轉(zhuǎn)膜至醋酸纖維素(PVDF)膜。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉2.5 h。一抗HSP70兔多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)用脫脂奶粉按1∶1 000稀釋，將封閉后的PVDF膜放入一抗4 ℃孵育過夜。次日用吐溫-磷酸鹽緩沖液(PBST)洗10min，重復(fù)3次；將二抗羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(bs-0295G-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)用脫脂奶粉按1∶1 000稀釋后，PVDF膜放入二抗孵育1.5 h。ECL曝光液(碧云天生物技術(shù)公司)(A液、B液體積比為1∶1避光混勻)滴加在PVDF膜上，暗室顯影30 s后用X光膠片曝光、顯影、定影。膠片晾干后用掃描儀采集圖片。用β肌動(dòng)蛋白(β-actin)做內(nèi)參。通過ImageJ軟件分析WB條帶表達(dá)量。

1.3　數(shù)據(jù)分析

分別選取牦牛不同胃組織的HSP70免疫組化切片各10張，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野(1 000×)，采用Image-Pro plus 6.0軟件測(cè)定HSP70陽(yáng)性反應(yīng)物的積分光密度值。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件對(duì)各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P<0.01時(shí)判為差異極顯著，P>0.05時(shí)判為差異不顯著。

2　結(jié)　果

2.1　牦牛皺胃的組織學(xué)特點(diǎn)

嗜銀染色結(jié)果表明，牦牛皺胃腺體間含有大量嗜銀細(xì)胞分布，且這些嗜銀細(xì)胞顯色強(qiáng)弱不同，有一定的差異。內(nèi)分泌細(xì)胞具較強(qiáng)的嗜銀性，呈黑褐色;壁細(xì)胞嗜銀性次之，呈棕黃色；主細(xì)胞無嗜銀性，不著色(圖1-A)。

AB-PAS染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皺胃腺體間的一些內(nèi)分泌細(xì)胞呈深紅色，壁細(xì)胞呈淡紅色，主細(xì)胞呈藍(lán)色(圖1-B)。

2.2　HSP70在牦牛各胃的分布

免疫組化結(jié)果顯示，在牦牛瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃，HSP70僅在黏膜上皮細(xì)胞層表達(dá)，呈棕黃色。其中，角質(zhì)層細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，基底層、顆粒層和棘細(xì)胞層的部分細(xì)胞呈中等陽(yáng)性反應(yīng)，部分細(xì)胞不表達(dá)(圖1-C、圖1-D、圖1-E)；在皺胃，HSP70不僅在黏膜表面上皮細(xì)胞有表達(dá)，胃腺間的內(nèi)分泌細(xì)胞及壁細(xì)胞也呈陽(yáng)性表達(dá)(圖1-F)。陽(yáng)性反應(yīng)主要集中在細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核。積分光密度值分析發(fā)現(xiàn)，HSP70在牦牛皺胃的陽(yáng)性反應(yīng)最強(qiáng)，瘤胃次之，網(wǎng)胃較低，瓣胃最低，各胃之間表達(dá)量的差異極顯著(P<0.01)(表1)。

2.3　HSP70在牦牛各胃的表達(dá)量

WB檢測(cè)結(jié)果顯示，HSP70在牦牛瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃均有表達(dá)(圖2)。采用ImageJ軟件分析發(fā)現(xiàn)，HSP70表達(dá)量在牦牛各胃間差異極顯著(P<0.01)，皺胃最高,瘤胃次之,網(wǎng)胃較低,瓣胃最低(表2)。

3　討　論

1987年學(xué)者在犬胃黏膜首次發(fā)現(xiàn)了一類能被鉻鹽染色的細(xì)胞，隨后研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有共同的特征，即在蘇木精-伊紅(HE)染色中很難辨認(rèn)，而經(jīng)嗜銀染色后觀察這些嗜銀細(xì)胞呈黑褐色或棕黃色，反差較強(qiáng)極易辨認(rèn)，學(xué)者推測(cè)此類細(xì)胞為內(nèi)分泌細(xì)胞[10]。牦牛作為反芻動(dòng)物，前胃(瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃)具有機(jī)械消化的作用，唯有皺胃腺體間含有大量的分泌細(xì)胞，具有真正消化意義的胃。因此，本試驗(yàn)采用嗜銀染色，對(duì)牦牛皺胃腺體間細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)牦牛皺胃腺體間也存在有大量嗜銀細(xì)胞。其中，內(nèi)分泌細(xì)胞呈黑褐色，壁細(xì)胞呈棕黃色，而主細(xì)胞卻無嗜銀現(xiàn)象。這與雙峰駝胃底腺的研究結(jié)果[11]相似。此外，該染色鑒別了牦牛皺胃腺體間的分泌細(xì)胞，為后期觀察免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞類型奠定了基礎(chǔ)。

A、A1、A2分別為皺胃、皺胃胃小凹、皺胃腺體，嗜銀染色；B、B1、B2分別為皺胃、皺胃胃小凹、皺胃腺體，AB-PAS染色；C、D、E分別為瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃，免疫組化染色；F、F1、F2分別為皺胃、皺胃胃小凹、皺胃腺體，免疫組化染色。EC:內(nèi)分泌細(xì)胞；PC:壁細(xì)胞；GP:胃小凹；CC:主細(xì)胞；SC:角質(zhì)層；SG:顆粒層；SS:棘層；SB:基底層。

A, A1and A2was the abomasum, the gastric pit of abomasum and the gland of abomasum, respectively, Gordon sweet staining; B, B1and B2was the abomasum, the gastric pit of abomasum and the gland of abomasum, respectively， AB-PAS staining; C, D and E was the rumen, the reticulum and the omasum, respectively, immunohistochemistry staining; F, F1and F2was the abomasums, the gastric pit of abomasum and the gland of abomasum, respectively， immunohistochemistry staining. EC: endocrine cell; PC: parietal cell; GP: gastric pit; CC: chief cell; SC: stratum corneum; SG: stratum granulosum; SS: stratums pinosum; SB: stratum basale.

圖1　牦牛胃的組織學(xué)與免疫組化檢測(cè)

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

圖2　HSP70在牦牛胃的表達(dá)

項(xiàng)目 ItemsHSP70 表達(dá)量 Expression of HSP70瘤胃 Rumen3.440 1±0.022 1b網(wǎng)胃 Reticulum3.170 6±0.119 4c瓣胃 Omasum2.710 5±0.035 1d皺胃 Abomasum3.796 7±0.151 1a

牦牛采食較為粗糙的飼草，對(duì)前胃黏膜上皮有較強(qiáng)的刺激損傷作用，而胃腸黏膜上皮作為機(jī)體內(nèi)增殖分化及凋亡最快的組織，細(xì)胞的損傷修復(fù)較快[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在同一組織中，不同細(xì)胞發(fā)生增殖分化及凋亡的周期過程并不同步[14]。Alwajeeh等[4]和Omar等[5]研究表明，HSP70抑制鼠胃組織細(xì)胞的凋亡，對(duì)胃具有重要的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，正常生理?xiàng)l件下HSP70在人、小鼠、大鼠胃黏膜的表達(dá)量較低，當(dāng)機(jī)體受到損傷刺激后，表達(dá)量呈顯著升高[15-18]。本試驗(yàn)采用免疫組化法及WB法研究發(fā)現(xiàn)，在牦牛前胃，HSP70在角質(zhì)層呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，推測(cè)可能與抑制胃黏膜細(xì)胞過度凋亡、加速細(xì)胞修復(fù)和保護(hù)胃黏膜有關(guān)；HSP70在基底層、顆粒層和棘細(xì)胞層的部分細(xì)胞中等陽(yáng)性反應(yīng)，部分細(xì)胞不表達(dá)。這種現(xiàn)象可能與細(xì)胞發(fā)生增殖分化及凋亡周期的過程不同步有關(guān)。更值得關(guān)注的是，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在牦牛前胃，HSP70表達(dá)量在瘤胃最高，網(wǎng)胃次之，瓣胃最低。牦牛瘤胃作為反芻動(dòng)物第1胃，是抵抗食物刺激的第1道防線，黏膜角質(zhì)化程度最高，損傷最大[19]。由此作者推測(cè)，HSP70在牦牛前胃的表達(dá)量差異可能與胃黏膜的損傷程度有關(guān)。這與Donnelly等[15]、Silva等[16]研究結(jié)果相似，即損傷刺激越嚴(yán)重，HSP70表達(dá)量越高。

已有研究證實(shí)，胃內(nèi)分泌細(xì)胞不僅自身具有分泌功能，還參與調(diào)控其他分泌細(xì)胞的分泌功能，它分泌的組胺對(duì)壁細(xì)胞分泌胃酸起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，刺激胃酸的分泌[20-21]。Wada等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胃酸可以誘導(dǎo)胃黏膜熱休克蛋白72(HSP72)的表達(dá)，從而降低胃酸對(duì)胃黏膜的損傷。當(dāng)胃內(nèi)pH異常，酸堿平衡失調(diào)時(shí)，是導(dǎo)致胃潰瘍的主要誘因，此時(shí)，胃可能通過自身機(jī)制誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，用于維持胃內(nèi)酸堿平衡，增強(qiáng)潰瘍的愈合[23-24]。Arora等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胃潰瘍損傷時(shí)，內(nèi)源性抗氧化酶升高及脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致HSP70上調(diào)，來保護(hù)胃黏膜。Marruchella等[6]研究發(fā)現(xiàn)，HSP70在豬食道黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)，起到保護(hù)食道黏膜不受損傷的作用。本試驗(yàn)經(jīng)免疫組化法和WB法檢測(cè)后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在牦牛皺胃，HSP70不僅黏膜表面上皮細(xì)胞有表達(dá)，腺體間的內(nèi)分泌細(xì)胞及壁細(xì)胞也呈陽(yáng)性表達(dá)。作者推測(cè)，這可能與保護(hù)皺胃胃黏膜免受損傷、調(diào)控胃內(nèi)分泌細(xì)胞及壁細(xì)胞的分泌功能有關(guān)，起到保護(hù)胃黏膜，調(diào)節(jié)胃內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，促進(jìn)食物消化吸收的作用；而HSP70表達(dá)量在皺胃顯著高于前胃，結(jié)合免疫組化結(jié)果推測(cè)，這種高表達(dá)可能與HSP70在皺胃廣泛的陽(yáng)性分布有關(guān)。值得思考的是，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，HSP70在皺胃壁細(xì)胞中未見陽(yáng)性反應(yīng)，其原因有待進(jìn)一步探索研究。

4　結(jié)　論

① 牦牛皺胃腺體間含有大量分泌細(xì)胞。

② HSP70在牦牛前胃角質(zhì)層細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，基底層、棘層及顆粒層部分細(xì)胞呈中等陽(yáng)性表達(dá)，部分細(xì)胞不表達(dá)。

③ 皺胃陽(yáng)性反應(yīng)分布范圍較廣，不僅黏膜上皮細(xì)胞有表達(dá)，腺體間內(nèi)分泌細(xì)胞及壁細(xì)胞也呈陽(yáng)性反應(yīng)。

④ HSP在牦牛4個(gè)胃均表達(dá)，其中皺胃表達(dá)量最高，瘤胃次之，網(wǎng)胃較低，瓣胃最低。