乳酸菌胞外多糖益生功能研究進(jìn)展

杜瑞平　郭　帥　潘　娜　修　磊　王麗思

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；3.包頭市固陽(yáng)縣農(nóng)牧業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，包頭 014200)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是公認(rèn)的綠色安全(generally regarded as safe，GRAS)級(jí)微生物，其在人體、動(dòng)物、植物和整個(gè)自然界中廣泛分布[1]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌主要通過(guò)在機(jī)體腸道內(nèi)定植來(lái)改善腸道微生態(tài)環(huán)境，并具有抗腫瘤、抗炎、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)等生理功效[2]。目前的研究表明乳酸菌的上述功能可能與其次生代謝產(chǎn)物胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)有關(guān)。自然界中產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌很多，目前研究的大多數(shù)菌株是從乳及乳制品、傳統(tǒng)的發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道中分離獲得的。近些年來(lái)，由于消費(fèi)者的需求重點(diǎn)向天然無(wú)殘留的安全健康的食品轉(zhuǎn)移，所以乳酸菌胞外多糖的性質(zhì)和生理功能受到越來(lái)越多的重視。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，乳酸菌胞外多糖已可以應(yīng)用于酸奶、干酪乳等食品中，并作為益生元加以利用[3]。同時(shí)，乳酸菌胞外多糖還作為天然添加劑應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、畜牧業(yè)等領(lǐng)域[4]。本文重點(diǎn)介紹了近些年來(lái)乳酸菌胞外多糖的益生功能及其作用機(jī)制研究進(jìn)展，并對(duì)其在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的研究進(jìn)展作一概述。

1　乳酸菌胞外多糖簡(jiǎn)介

多糖是一類(lèi)由醛糖或酮糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的天然高分子聚合物，廣泛分布于動(dòng)植物、真菌、藻類(lèi)和細(xì)菌中，根據(jù)來(lái)源不同可分為動(dòng)物多糖、植物多糖和微生物多糖(真菌多糖、藻類(lèi)多糖和細(xì)菌多糖)。微生物多糖的存在形式主要包括構(gòu)成微生物細(xì)胞成分的胞內(nèi)多糖、黏附在細(xì)胞表面作為維持細(xì)胞形態(tài)的結(jié)構(gòu)性多糖以及分泌到培養(yǎng)基中的胞外多糖[5]。作為細(xì)菌多糖目前的主要研究對(duì)象，乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中合成并分泌于細(xì)胞外或滲入培養(yǎng)基中的多糖及其混合物，可以分為莢膜多糖和黏液多糖[6-7]，又可以分為同多糖(homopolysaccharide，HoPS)和雜多糖(heteropolysaccharide，HePS)[8]。乳酸菌胞外多糖中單糖種類(lèi)和組成比例受到菌株類(lèi)型、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。大量研究結(jié)果表明，乳酸菌胞外多糖在幫助微生物抵御脫水、營(yíng)養(yǎng)缺乏、噬菌體、滲透壓、拮抗物和有毒物質(zhì)等不利條件時(shí)發(fā)揮重要作用[9]，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等生理活性[6]。

2　乳酸菌胞外多糖的生理調(diào)節(jié)作用

2.1　免疫調(diào)節(jié)作用

乳酸菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)功能主要是通過(guò)激活免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)、促進(jìn)單核細(xì)胞吞噬能力和調(diào)控免疫細(xì)胞因子(如補(bǔ)體、白細(xì)胞介素等)的分泌來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[10-11]。Kishimoto等[12]將德氏乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖作用于人的腸上皮Caco-2細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，結(jié)果顯示這2種細(xì)胞均分泌了大量的腫瘤壞死因子α(TNF-α)和多種細(xì)胞因子。Morifuji等[13]研究發(fā)現(xiàn)，給9周齡的小鼠連續(xù)灌胃發(fā)酵乳或者胞外多糖10 d后，將小鼠背部皮膚暴露于紫外線(20 mJ/cm2)中，小鼠背部皮膚無(wú)損傷，表明無(wú)論是攝入發(fā)酵乳還是胞外多糖都能顯著減弱紫外線所誘導(dǎo)的紅斑形成、皮膚干燥及表皮增殖。分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)從乳酸菌發(fā)酵乳中分離出的胞外多糖增強(qiáng)了DNA的修復(fù)機(jī)制并提高了皮膚的免疫力，因而能夠保護(hù)皮膚免受紫外線損傷。乳酸菌胞外多糖還可分為酸性胞外多糖(APS)和中性胞外多糖(NPS)[14]。Nishimura-Uemura等[15]利用保加利亞乳桿菌OLL1073R-1產(chǎn)生的NPS和APS來(lái)培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞J774.1，并以巨噬細(xì)胞形態(tài)以及一氧化氮(NO)、細(xì)胞因子的產(chǎn)量為指標(biāo)，探究乳酸菌胞外多糖引起的巨噬細(xì)胞功能的變化，結(jié)果顯示：在細(xì)胞形態(tài)方面，APS能夠刺激巨噬細(xì)胞激活，而NPS幾乎無(wú)刺激作用；NPS和APS均不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO；小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)APS刺激后細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量高于NPS刺激后的表達(dá)量。該試驗(yàn)結(jié)果證明該菌所產(chǎn)APS具有促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞免疫功能的作用。

乳酸菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)作用也可能與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究顯示，含有磷酸基團(tuán)或者硫酸基團(tuán)的胞外多糖能更有效地誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖、活化或分泌細(xì)胞素類(lèi)物質(zhì)[16]。Laio等[17]闡述了乳酸菌胞外多糖發(fā)揮免疫功能的一種新分子機(jī)制，研究中以小腸上皮細(xì)胞為模型，探究2種乳酸菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖與宿主細(xì)胞的分子間相互作用，結(jié)果顯示2種乳酸菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖均能降低缺乏Toll樣受體(TLR)細(xì)胞的炎性因子表達(dá)量；已知胞外多糖可以依賴(lài)于TLR2、TLR4和TLR信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控發(fā)揮免疫作用，在此基礎(chǔ)上，該研究還發(fā)現(xiàn)乳酸菌和胞外多糖以RP105/MD1途徑來(lái)減少小腸上皮細(xì)胞的炎癥。因此，從目前的研究來(lái)看，由于乳酸菌胞外多糖具有菌株特異性，不同菌株產(chǎn)生的胞外多糖種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量等的物化差異性較大，這些差異性直接導(dǎo)致了這些胞外多糖具有不同的特定功能，因此，在對(duì)新分離的乳酸菌胞外多糖的功能篩選時(shí)，對(duì)其進(jìn)行免疫活性的研究是非常有必要的。

2.2　抗腫瘤功能

能產(chǎn)生胞外多糖的乳酸菌種類(lèi)有很多，其中能產(chǎn)生具有抗腫瘤作用的胞外多糖所對(duì)應(yīng)的乳酸菌目前探明的包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)等20多種[18-19]。目前，研究者們對(duì)某些具有抗腫瘤、抗癌活性的乳酸菌胞外多糖展開(kāi)了研究。Wang等[20]研究了植物乳桿菌70810所產(chǎn)胞外多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG-2、BGC-823和HT-29的抗腫瘤活性，結(jié)果顯示，胞外多糖對(duì)3種腫瘤細(xì)胞均有較高的抑制率[依次為(56.34±1.07)%、(61.57±2.07)%、(88.34±1.97)%]，尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞BGC-823和HT-29。所以，植物乳桿菌70810所產(chǎn)的胞外多糖可能適合作為功能食品和天然抗腫瘤藥物。劉鷺等[21]研究了硒化乳酸菌胞外多糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞和宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)的影響，結(jié)果顯示，加入胞外多糖后2種癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)動(dòng)態(tài)下降趨勢(shì)。其作用機(jī)制可能與胞外多糖進(jìn)行硒化修飾有關(guān)，即硒化后的胞外多糖與腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的減少，由此說(shuō)明硒化后的胞外多糖可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡。Ismail等[22]提取了植物乳桿菌MTCC 9510的胞外多糖作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由植物乳桿菌MTCC 9510產(chǎn)生的胞外多糖的確對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制作用，證明了胞外多糖的確有抗腫瘤作用。Wang等[23]通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)，研究了不同濃度(50、100、200、400和600 μg/mL)和不同時(shí)間(24和72 h)條件下植物乳桿菌YW32產(chǎn)生的胞外多糖的抗腫瘤活性，結(jié)果顯示，胞外多糖的抑制活性具有濃度依賴(lài)性，在胞外多糖劑量為600 μg/mL時(shí)具有最高的抑制率(39.24%)。據(jù)Leng等[24]報(bào)道，乳酸菌胞外多糖的抗氧化和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平可能與癌細(xì)胞的生成與轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，高的抗氧化水平可能增強(qiáng)抗腫瘤活性。Wang等[23]推測(cè)，來(lái)源于植物乳桿菌YW32的胞外多糖的抗腫瘤活性可能與其對(duì)羥基和超氧自由基的清除能力有關(guān)，故來(lái)源于植物乳桿菌YW32的胞外多糖可以作為天然健康食品用于結(jié)腸癌的治療。此外，還有文獻(xiàn)指出抗腫瘤活性的差異可能與乳酸菌胞外多糖的組成、分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)以及硫酸鹽的含量有關(guān)[25-26]。

目前發(fā)現(xiàn)的乳酸菌胞外多糖抗腫瘤機(jī)制可能為以下幾種：1)通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗氧化能力來(lái)間接實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用；2)通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用；3)乳酸菌利用胞外多糖增加在腸腔內(nèi)定植，從而競(jìng)爭(zhēng)性排斥致癌病原菌在腸腔內(nèi)的黏附。此外，產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌能夠降低腸道內(nèi)細(xì)菌酶、β-葡萄糖醛酸酶等的活性，減少具有致癌作用的次級(jí)膽酸量，降低患癌的風(fēng)險(xiǎn)[27]。

2.3　抗氧化功能

對(duì)于胞外多糖的抗氧化機(jī)制，目前還沒(méi)有確定的結(jié)論，可能的機(jī)制包括：1)多糖分子直接作用于自由基本身，或結(jié)合分解成對(duì)機(jī)體無(wú)害的產(chǎn)物，或發(fā)生氧化反應(yīng)直接清除；2)多糖分子的螯合催化作用，自由基反應(yīng)過(guò)程受阻；3)多糖分子通過(guò)提高機(jī)體抗氧化酶系活力而發(fā)揮抗氧化作用[31]。此外，還有報(bào)道認(rèn)為分子質(zhì)量可能與多糖的抗氧化活性有關(guān)，分子質(zhì)量越小，抗氧化活性越強(qiáng)[32]。

2.4　對(duì)機(jī)體腸道功能的調(diào)節(jié)作用

乳酸菌胞外多糖主要通過(guò)改善腸黏膜的黏附、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡以及為腸道供能的方式，對(duì)機(jī)體腸道起到一定的調(diào)節(jié)作用，其對(duì)腸黏膜的黏附主要依賴(lài)黏附素，包括脂磷壁酸、完整肽聚糖、表層蛋白和胞外多糖等[33]，其中胞外多糖起重要作用。乳酸菌胞外多糖對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附作用有助于其在腸道定植、增強(qiáng)乳酸菌與腸道細(xì)胞之間的信號(hào)交流、抑制病原菌在腸道的定植和提高機(jī)體免疫力[34]。乳酸菌胞外多糖增強(qiáng)益生菌對(duì)腸道的黏附作用主要包括特異性黏附和非特異性黏附2個(gè)途徑。進(jìn)入腸道后，乳酸菌首先依靠非特異性黏附作用在腸道表面定植，但這種黏附作用力不強(qiáng)，具有可逆性，其分泌的胞外多糖可以增強(qiáng)益生菌在腸道的黏附作用。乳酸菌經(jīng)非特異性黏附在腸道局部聚集后，菌體接著會(huì)發(fā)揮特異性黏附作用和宿主細(xì)胞進(jìn)行特異性識(shí)別與黏附[35]。

Li等[36]研究了兩歧雙歧桿菌WBINO3對(duì)小鼠腸道微生物多樣性的影響，結(jié)果顯示，其所產(chǎn)胞外多糖能顯著提高小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌和厭氧菌的數(shù)量，抑制腸細(xì)菌、腸球菌和脆弱類(lèi)桿菌的增殖，從而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖到達(dá)人體結(jié)腸部位后能夠被腸道菌群分解成短鏈脂肪酸和乳酸鹽。B?ckhed等[37]發(fā)現(xiàn)由乳酸菌胞外多糖分解產(chǎn)生的短鏈脂肪酸能夠?yàn)槿梭w提供10%的能量。另有報(bào)道稱(chēng)，分子質(zhì)量大(>106u)的乳酸菌胞外多糖能夠抵抗體外模擬的胃液和腸液的降解，并可作為結(jié)腸發(fā)酵的基質(zhì)，為結(jié)腸提供能量[38]。此外，也有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖可作為腸道菌群發(fā)酵的碳源，為菌群提供營(yíng)養(yǎng)[39]。

3　乳酸菌胞外多糖在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的研究進(jìn)展

相比其他種類(lèi)的多糖，包括乳酸菌胞外多糖在內(nèi)的細(xì)菌多糖可以通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)，并具有生產(chǎn)周期短，不受時(shí)間、空間等條件限制等優(yōu)點(diǎn)而具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用市場(chǎng)[40]。目前黃芪多糖、靈芝多糖等多種多糖添加劑已被廣泛應(yīng)用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，很好地提高了動(dòng)物機(jī)體的免疫力，增強(qiáng)了抗病力。但目前關(guān)于乳酸菌胞外多糖生理活性的研究仍主要集中于人類(lèi)、鼠類(lèi)等試驗(yàn)?zāi)Ｐ突蛘咴隗w外細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行，其動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)上的研究和應(yīng)用并不多見(jiàn)，少量研究以單胃動(dòng)物(豬、雞)為主，反芻動(dòng)物則未見(jiàn)報(bào)道。Chen等[41]研究了羅伊氏乳桿菌胞外多糖對(duì)抗仔豬腸毒性大腸桿菌(ETEC)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，該乳桿菌胞外多糖通過(guò)減少腸毒性大腸桿菌在小腸內(nèi)的定植黏附來(lái)減緩仔豬腹瀉的發(fā)生。Le等[42]通過(guò)給斷奶仔豬飼喂羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的小麥發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵谷物并沒(méi)有對(duì)試驗(yàn)仔豬的腸道形態(tài)、小腸發(fā)酵、生長(zhǎng)性能及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率產(chǎn)生顯著影響，但乳桿菌所產(chǎn)胞外多糖能刺激后腸發(fā)酵，提高機(jī)體健康水平。路則慶[43]研究了E.cloacaeZ0206富硒多糖(Se-ECZ-EPS)對(duì)肉仔雞和斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、胴體品質(zhì)、免疫功能及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和腸道微生物多樣性的影響，結(jié)果表明Se-ECZ-EPS增強(qiáng)了肉仔雞和仔豬的免疫功能，有效提高了其生長(zhǎng)性能。雖然該研究使用的是從肉靈芝中分離得到的屬于陰溝腸桿菌屬細(xì)菌所產(chǎn)胞外多糖進(jìn)行的試驗(yàn)，但其研究思路和方法值得在乳酸菌胞外多糖上借鑒開(kāi)展。筆者所在課題組對(duì)植物來(lái)源高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株進(jìn)行了篩選鑒定和分離純化，已得到多株優(yōu)良菌株，并利用小鼠模型對(duì)這些乳酸菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化功能進(jìn)行了充分研究[44]，下一步擬在羔羊和犢牛等幼齡反芻動(dòng)物上開(kāi)展應(yīng)用試驗(yàn)，以期為乳酸菌胞外多糖的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

4　小　結(jié)

從近些年來(lái)對(duì)乳酸菌胞外多糖生理活性功能的研究可知，其有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和益生功能等多種作用。故理論上乳酸菌可應(yīng)用于酸奶等發(fā)酵食品中，達(dá)到改善酸奶流變學(xué)性質(zhì)、質(zhì)地、風(fēng)味、調(diào)節(jié)腸道等作用；也可應(yīng)用于動(dòng)物飼料添加劑，以代替抗生素使用；還可以用于醫(yī)療和保健等方面，促進(jìn)人類(lèi)健康。但目前乳酸菌胞外多糖僅僅在乳制品的發(fā)酵與制備方面實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，而在其他方面實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還有諸多困難，其中最大的障礙是乳酸菌胞外多糖的轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)成本高。所以，目前關(guān)于乳酸菌胞外多糖研究的關(guān)鍵是通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)手段獲得高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株，實(shí)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖的高產(chǎn)并投入到工業(yè)化生產(chǎn)中。另外，目前乳酸菌胞外多糖的動(dòng)物試驗(yàn)還停留在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物及單胃動(dòng)物模型上，在反芻動(dòng)物上基本未見(jiàn)研究報(bào)道，今后可在犢牛、羔羊等幼齡反芻動(dòng)物上開(kāi)展研究，進(jìn)一步拓寬乳酸菌胞外多糖在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用，充分發(fā)揮其綠色飼料添加劑的巨大潛力。