富血小板纖維蛋白(PRF)促進(jìn)骨再生的研究進(jìn)展

張　斌，王　信，敖　俊

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨外科，貴州 遵義　563099；2.貴州省骨科醫(yī)院 骨外科，貴州 貴陽　550002)

大節(jié)段的骨組織缺損是臨床骨科醫(yī)師面臨的一大難題[1]。臨床實(shí)踐中治療骨缺損主要應(yīng)用骨移植技術(shù)，移植物的理想材料是自體骨，但自體骨有骨量少和取骨處并發(fā)癥等缺點(diǎn)[2]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展，骨水泥材料和人工骨移植技術(shù)已經(jīng)較為廣泛地應(yīng)用于臨床，但至今仍存在一些問題。例如，骨水泥存在生物相容性差，可吸收性差，成形過程放熱大，體內(nèi)成形固化速率慢，柔韌度較差等弊端[3-4]；人工骨移植存在來源限制與排斥反應(yīng)等問題[5]。此時(shí)，骨組織工程讓我們看到曙光，有望最終解決這個(gè)問題[6-9]。

近年來的研究顯示富血小板纖維蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)對(duì)骨再生有促進(jìn)作用[10-12]。PRF作為第二代血小板濃聚物(Platelet concentrates,PC)，來源于自體外周血液，制作過程無生物或化學(xué)制劑，自體移植生物安全性得到保證[13]。本文將對(duì)PRF的主要制備方法、分類及細(xì)胞因子(Cytokine,CK)的釋放、粘附到成骨作用綜述如下。

1　PRF主要分類、特點(diǎn)及制備方法

PRF由Choukroun等[13]首先提出，之后稱之為Choukroun’s PRF或L-PRF(Leucocyte- and platelet-rich fibrin)，其制備過程不需要加入任何抗凝劑和凝血酶。方法如下：取10 mL全血(來源于人外周靜脈)，立即以3000 rpm離心10 min。離心后上層為貧血小板血漿(Platelet-poor plasma,PPP)，底層為紅細(xì)胞(Red blood cells,RBCs)，兩層之間的白色絮狀物則是L-PRF。離心后凝血酶和凝血因子主要分布于上層血清中，待其自然沉降至中層，則可使L-PRF中的纖維蛋白原激活并聚合，形成L-PRF凝塊[14](見圖1)。研究證實(shí)，L-PRF對(duì)多種組織有明顯修復(fù)、再生作用，被廣泛引用于骨科、口腔科、頜面外科等學(xué)科的手術(shù)中[15-17]。由于L-PRF中含有大量白細(xì)胞，所以它對(duì)局部還有抗感染作用[18]。

Ghanaati和Choukroun等[19]在原有的L-PRF的基礎(chǔ)上改良并研制出A-PRF(Advanced platelet-rich fibrin)，其制作方法為：10 mL全血(來源于人外周靜脈)，無菌條件下以1500 rpm離心14 min完成制作。A-PRF中的嗜中性粒細(xì)胞較L-PRF多，更能刺激單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，釋放更多生長因子(Growth factors,GFs)，有利于骨和軟組織再生，是目前臨床應(yīng)用的一個(gè)主要方向。

i-PRF(Injectable platelet-rich fibrin)是一種液態(tài)狀的PRF。其制備方法是：10 mL全血，在不加入任何抗凝劑的情況下，通過雙重離心機(jī)以700 rpm離心3 min，取上中層血漿1 mL即得i-PRF[20]。得益于i-PRF的液態(tài)屬性，使得它能更好地與其他外科植入物充分混合，如植骨顆粒，從而促進(jìn)軟組織和硬組織的愈合[21]。

上層為貧血小板血漿(PPP)；底層為紅細(xì)胞(RBCs)；兩層之間則是富血小板纖維蛋白(L-PRF)?！　D1　兔靜脈全血5 mL在3 000 rpm離心10 min的條件下制作L-PRF

Ly-PRF(Lyophilized platelet-rich fibrin)是指冷凍的PRF。與新鮮L-PRF相比，其體積大，能長時(shí)間保存其內(nèi)GFs的活性和數(shù)量，并且可以促進(jìn)干細(xì)胞遷移。Ly-PRF的制作方法：10 mL全血，按照L-PRF制作方法制得新鮮L-PRF膜，將其裝于冷藏瓶中，放于4 ℃冰箱中30 min，然后存放于-80 ℃冰箱中冷藏，之后于-51 ℃冷凍干燥機(jī)中過夜即制得。Ly-PRF可以在顱面骨再生和礦化組織再生中作為生物支架使用，提升L-PRF的成骨潛力[22]。

2　PRF中所含CK

PRF中含有許多可溶性CK，其中包括促炎性反應(yīng)因子、抗炎性反應(yīng)因子和GFs，這些可溶性CK是炎癥反應(yīng)和組織愈合過程的重要媒介[23]。

2.1PRF的抗感染作用及主要促炎性反應(yīng)因子促炎性反應(yīng)因子中起主要作用的是白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)。

IL-1β是炎性反應(yīng)主要的調(diào)控因子之一，它主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、朗漢斯巨細(xì)胞等分泌[24-25]。其可調(diào)控破骨細(xì)胞，與TNF-α聯(lián)合時(shí)可以促進(jìn)骨溶解，抑制成骨[26]。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)，在鼠骨延遲愈合模型中IL-1β明顯增高。而高濃度的IL-1β能直接促進(jìn)致密的纖維凝塊形成，從而阻礙骨缺損的愈合進(jìn)程[28]。

IL-6可以刺激B淋巴細(xì)胞分化，促使抗體分泌，并且可以增加CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)，與TNF-α和IL-1β協(xié)同抗感染[29]。作為免疫循環(huán)調(diào)控點(diǎn)之一，IL-6的分泌與IL-1β、TNF-α、血小板源性生長因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)、細(xì)菌內(nèi)毒素的刺激有關(guān)，并且受IL-6自身調(diào)控，起到激活和抑制自身的作用[30]。IL-6可以抑制破骨細(xì)胞的成熟、分化，從而使骨溶解減少，有利于減少原有骨細(xì)胞和新生骨細(xì)胞的丟失[31]。也有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠骨折后體內(nèi)IL-6增高，通過阻斷IL-6受體，可以使成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)上調(diào)而促進(jìn)成骨[32]。

TNF-α由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等分泌，是免疫反應(yīng)中首先被釋放，它可以刺激成纖維細(xì)胞生長和塑形[33-35]。TNF-α與IL-1β和IL-6同在一個(gè)調(diào)控循環(huán)中，它是刺激IL-1β和IL-6分泌的重要因子[30]。當(dāng)骨折發(fā)生后，體內(nèi)TNF-α分泌增加[32]，而TNF-α增加可以降低成骨細(xì)胞的存活率[36]。

上述各類型的PRF均含有大量白細(xì)胞，這是PRF抗感染作用的重要因素[19,37]。

2.2抗炎性反應(yīng)因子抗炎性反應(yīng)因子主要包括白介素-1Ra(Interleukin-1Ra,IL-1Ra)、白介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor -β1,TGF-β1)。

IL-1Ra在與IL-1同樣的刺激因素下合成、釋放，與IL-1形成拮抗[38]。IL-1Ra在早期巨噬細(xì)胞中釋放較多，在晚期巨噬細(xì)胞中釋放較少，當(dāng)IL-1Ra釋放量少時(shí)可能會(huì)延遲骨折愈合[39]。

IL-4主要由TH2 CD4+T細(xì)胞分泌。IL-4通過增加B細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用促進(jìn)體液免疫。IL-4抗炎性反應(yīng)作用表現(xiàn)在與IL-1β、TNF-α、前列腺素(Prostaglandin,PG)的產(chǎn)物拮抗，從而減少細(xì)胞對(duì)干擾素-γ(Interferon-γ,INF-γ)和內(nèi)毒素的應(yīng)答[40]。在不同階段，T細(xì)胞可以分泌3種不同狀態(tài)的IL-4產(chǎn)物，包括：原始狀態(tài)、激活狀態(tài)/記憶狀態(tài)、效應(yīng)狀態(tài)/記憶狀態(tài)，以此調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[41]。研究發(fā)現(xiàn)，鼠體內(nèi)骨量增加時(shí)IL-4明顯增高，而骨量減少時(shí)IL-4相對(duì)較低[42]。

IL-10由T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等分泌，通過抑制INF-γ、TNF-α的炎性產(chǎn)物起到抗炎作用，幫助骨愈合[43]。

TGF-β1在內(nèi)環(huán)境中維持免疫應(yīng)答和防止自身不良免疫應(yīng)答[44]，抵消和平衡炎性反應(yīng)所導(dǎo)致的不良反應(yīng)，其對(duì)腫瘤也有一定的防御作用[40]。

2.3GFs釋放、粘附和成骨作用GFs中起明顯作用的是TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、PDGF、胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor,IGF)。這些因子在組織損傷后隨著血液聚集到損傷部位，刺激血管、肉芽組織、骨組織等生成來修復(fù)損傷[45]。

TGF-β1主要作用是通過成纖維細(xì)胞或成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白[46]，使細(xì)胞外基質(zhì)重塑，促進(jìn)骨折愈合[47-48]。反之，TGF-β1減少可能會(huì)導(dǎo)致骨延遲愈合或骨不連[49]。

VEGF主要作用是支持和協(xié)調(diào)血管等重要結(jié)構(gòu)早期形成，直接調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、分化和存活[50-51]，以及對(duì)成骨細(xì)胞分化起到刺激作用，是骨修復(fù)中的重要GFs之一[52]。

PDGF主要作用是調(diào)節(jié)干細(xì)胞系遷移、增殖、存活，在疤痕形成和組織塑形過程中起到重要作用[53-54]。PDGF還是成骨細(xì)胞趨化和有絲分裂的激動(dòng)因子，可以促進(jìn)成骨[55]。

IGF能夠促進(jìn)所有細(xì)胞增殖和分化，其中也包括腫瘤細(xì)胞[56]。有研究表明IGF-1能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、存活，促進(jìn)管狀結(jié)構(gòu)形成，以及對(duì)抗內(nèi)皮損傷[57]。IGF-1是骨骼中含量最高的GF，它可以通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌機(jī)制調(diào)節(jié)生長素(Growth hormone，GH)和甲狀旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)來促進(jìn)成骨[58]。

有研究發(fā)現(xiàn)，L-PRF中含有大量TGF-β1和PDGFs，L-PRF中TGF-β1的含量約為普通血清的1.39倍；PDGFs的含量約為普通血清的1.68倍[59]。Dohan[60]等通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，L-PRF能在至少7 d內(nèi)大量持續(xù)釋放3種主要GFs(TGF-β1,PDGF,VEGF)和1種重要的基質(zhì)細(xì)胞凝固糖蛋白——血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)，他們認(rèn)為L-PRF中有大量因子的重要因素是白細(xì)胞將這些因子鎖在纖維基質(zhì)中。Su[61]等研究發(fā)現(xiàn)，L-PRF中所含的GFs在300 min時(shí)釋放量最大，并且發(fā)現(xiàn)在300 min時(shí)PPP中也含有大量穩(wěn)定的GFs，他們建議L-PRF制作完成后應(yīng)立即植入體內(nèi)。Schar[62]等發(fā)現(xiàn)，L-PRF與富血小板血漿(Platelet-rich plasma,PRP)、血凝塊相比，L-PRF中TGF-1含量最高，釋放峰值在第7天；IGF-1和PDGF-AB的總含量無區(qū)別，IGF-1在前3 d內(nèi)緩慢釋放，PDGF-AB則是逐漸釋放；VEGF的釋放峰值同樣出現(xiàn)在第7天。為研究L-PRF制作條件對(duì)GFs的影響，Eren等[63]發(fā)現(xiàn)離心時(shí)間對(duì)GFs(VEGF除外)無影響，離心12 min時(shí)VEGF可能對(duì)組織愈合較好，并且能在72 h達(dá)到峰值。

Masuki等[64]，通過對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在A-PRF中的含量與在濃縮生長因子(Concentrated growth factors,CGF)中的含量無差異，但是明顯高于PRP中的含量；雖然PDGF-BB在A-PRF中含量的平均值稍低于CGF中含量的平均值，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而兩者均明顯高于PRP中PDGF-BB含量的平均值；VEGF在A-PRF中含量的平均值稍高于在CGF中含量的平均值，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩者所含VEGF的量也均明顯高于PRP中所含的量。Kobayashi等[65]研究發(fā)現(xiàn)，A-PRF在10天內(nèi)釋放GFs和蛋白的總量高于L-PRF。

Miron等[66]的研究發(fā)現(xiàn)，i-PRF在10 d內(nèi)大量釋放GFs，其中PDGF-AB、PDGF-BB、IGF-1的總量均高于在PRP中的總量。Choukroun等[67]認(rèn)為，i-PRF通過低速離心，能夠使更多白細(xì)胞、血小板和GFs粘附在其內(nèi)部的纖維上，但其對(duì)于細(xì)胞的影響和組織愈合作用有待進(jìn)一步研究。

Zhang[68]等發(fā)現(xiàn)PDGF-BB、TGF-β1在Ly-PRF和新鮮L-PRF中的含量無明顯差異，即使在-196℃冷藏后也不會(huì)影響生物因子的表達(dá)。

3　PRF骨再生研究

3.1PRF治療骨缺損許多研究表明PRF有成骨作用之后，PRF也因此被應(yīng)用于臨床上治療骨缺損?？谇活M面外科率先將L-PRF應(yīng)用于牙周骨缺損、口腔骨囊腫術(shù)后骨缺損、牙槽骨缺損、上下頜骨缺損等治療并取得了滿意的療效。在口腔中L-PRF膜不僅可以使骨缺損處與口腔隔開，早期形成軟組織愈合，而且還能顯著地加速骨修復(fù)[69-74]。

3.2PRF聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)促進(jìn)成骨作用MSCs是再生醫(yī)學(xué)的重要研究方向之一，不少學(xué)者將L-PRF和MSCs搭配，進(jìn)行骨再生研究。Dohan等[75]將人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)與L-PRF在體外共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)L-PRF對(duì)BMSCs的增殖和分化都有促進(jìn)作用，分化作用與L-PRF的劑量有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)L-PRF與BMSCs共培養(yǎng)可有很多礦化點(diǎn)出現(xiàn)。另一方面，研究表明L-PRF能夠促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)遷移、增殖和分化，促進(jìn)血管生成，可以治療鼠急性心肌梗死模型[76-77]，而且還有異位成骨作用[78]。Zhou等[79]用BMSC-PRF復(fù)合物，經(jīng)過12周成功對(duì)兔下頜骨缺損修復(fù)。Wang等[80]以Hydroxyapatite-BMSC-PRF復(fù)合物治療兔顱骨15mm標(biāo)準(zhǔn)骨缺損取得滿意療效。L-PRF與MSCs復(fù)合物被用于臨床也取得滿意的療效，Dallari等[81]以BMSC-PRF復(fù)合物治療人股骨或脛骨骨不連病例，他們認(rèn)為BMSC-PRF復(fù)合物配合標(biāo)準(zhǔn)外科治療，可以縮短骨不連愈合的時(shí)間，使患者早期活動(dòng)，減少并發(fā)癥發(fā)生以及降低治療費(fèi)用。

3.3PRF聯(lián)合植入材料治療骨缺損對(duì)于臨床骨科中骨缺損治療，常常需要植入物具備一定生物力學(xué)強(qiáng)度，單純植入PRF、細(xì)胞-PRF混合物對(duì)局部力學(xué)支撐不足。即便Ly-PRF為固態(tài)，具有一定力學(xué)強(qiáng)度[22,68,82]，但植入后的力學(xué)強(qiáng)度變化與植入時(shí)間的關(guān)系鮮有報(bào)道。Choukroun等[83]在提出PRF早期就研究了L-PRF對(duì)同種異體骨在鼻竇增高術(shù)中骨成熟的影響，他們發(fā)現(xiàn)L-PRF能夠促進(jìn)骨愈合，并從組織學(xué)觀察，L-PRF與同種異體骨聯(lián)合植骨，至少可減少4個(gè)月的愈合時(shí)間。Kim等[84]將PRF-三磷酸鈣(Tricalcium phosphate,TCP)、單純TCP和人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP2)-TCP分為3組分別植入到直徑8 mm的兔上頜骨前竇壁骨缺損模型中進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PRF-TCP組、rhBMP2-TCP組均可在第2周明顯成骨、塑形及鈣化，但經(jīng)過8周比較，PRF-TCP成骨速度最快。Nacopoulos等[85]將L-PRF與羥基磷灰石、TCP復(fù)合，發(fā)現(xiàn)其可以為成骨提供更好的力學(xué)和結(jié)構(gòu)支撐。Yoon等[86]將L-PRF與異種骨結(jié)合，治療兔顱骨缺損，發(fā)現(xiàn)其不僅可以促進(jìn)骨再生，而且還可以促進(jìn)血管生成。Kokdere等[87]將L-PRF與自體骨顆?；旌现委熤睆? mm的兔脛骨骨缺損模型，發(fā)現(xiàn)L-PRF與自體骨混合植入，早期就可以促進(jìn)新骨形成，并對(duì)骨愈合起到積極作用。Chandradas等[88]將L-PRF與去礦化骨基質(zhì)混合，治療牙周骨缺損取得滿意療效，通過影像學(xué)發(fā)現(xiàn)新生骨質(zhì)填充缺損處。Song等[89]在低溫下以納米二磷酸鈣-聚乙烯醇為材料打印3D生物支架，搭載L-PRF并種植BMSCs進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二磷酸鈣-聚乙烯醇-PRF支架在體外比二磷酸鈣-聚乙烯醇支架能使BMSCs更好地粘附、增殖和成骨分化；二磷酸鈣-聚乙烯醇-PRF-BMSCs支架植入經(jīng)典兔橈骨缺損模型中有大量成骨，且成骨量明顯高于以二磷酸鈣-聚乙烯醇-BMSCs支架組和二磷酸鈣-聚乙烯醇-BMSCs未經(jīng)打印直接植入組。

4　展望

PRF屬于第二代PC，制作方法相對(duì)簡單，制作過程中不需要加入任何生物、化學(xué)制劑[13]，能夠穩(wěn)定、大量釋放GFs，GFs在300 min內(nèi)出現(xiàn)釋放高峰，約在7 d內(nèi)大量釋放，持續(xù)釋放時(shí)間約10 d[60-61,65-66]。L-PRF、A-PRF、i-PRF、Ly-PRF中均含有大量白細(xì)胞，白細(xì)胞對(duì)局部有抗感染作用，并且能將GFs粘附在PRF基質(zhì)中，還可以促進(jìn)MSCs遷移、增殖、分化[19,37]，而這些GFs正是PRF能夠促進(jìn)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的主要因素之一，并且PRF中所含纖維網(wǎng)可以對(duì)組織再生提供空間結(jié)構(gòu)支持，對(duì)新血管生成、骨再生提供極大幫助[90]。

綜上所述，PRF可制備成液態(tài)、凝膠和固態(tài)，無論哪種形態(tài)都能保持其中含有大量GFs，這對(duì)成骨有積極的促進(jìn)作用。由于PRF的成分均源自于自體血液，當(dāng)它被植入后，具有低免疫性、可完全吸收等優(yōu)勢(shì)，另外它還能與多種材料復(fù)合促進(jìn)成骨[83-88]，是骨再生研究中的一種具有明顯成骨作用、可塑性強(qiáng)、潛力巨大的自體生物材料。